Czytaj książkę: «БИОХИМИЯ (практикум)»
Розанцева Любовь Эдуардовна Салитринник Леонид Израилевич
Суслянок Георгий Михайлович
БИОХИМИЯ
Лабораторный практикум
для подготовки студентов по направлениям
06.03.01 Биология
19.03.03 Продукты питания животного происхождения
36.03.01 Ветеринарно-санитарная экспертиза по специальности
36.05.01 Ветеринария
МОСКВА 2020
УДК
577.1(075.8)
ББК 28.072я73
Б63
Биохимия : лабораторный практикум /
Л.Э.Розанцева, Л.И. Салитринник, Г.М.Суслянок — М.: Издательство «Ким Л.А.», 2020 – 128с.
Практикум предназначен помочь студентам в усвоении теоретического курса по дисциплине «Биохимия» и должен быть использован при выполнении лабораторных работ. В практикуме представлено описание лабораторных работ по изучению строения, свойств и обмена важнейших биомолекул: белков, углеводов, липидов, ферментов, витаминов, гормонов. Часть работ посвящена биохимии мышечной ткани и крови. В конце каждой работы даются вопросы, позволяющие студенту самостоятельно проконтролировать свои знания.
ISBN 978-5-6044922-1-5
© Розанцева Л. Э. Салитринник Л.И. Суслянок Г.М., 2020
© Изд-во «Ким Л.А.», 2020
В В Е Д Е Н И
Е
Лабораторный практикум составлен в соответствии с учебными пла-нами и рабочими программами курса «Биохимия» и предназначен помочь студентам в усвоении теоретического курса по дисциплине. Пособие долж-но быть использовано при выполнении лабораторных работ, в процессе ко-торых студенты знакомятся с методами биохимического анализа, необходи-мыми в будущем для работы по направлению подготовки и специальности. Изложенные в лабораторном практикуме методики могут быть ис-пользованы в научно-исследовательской работе студентов в области
биотехнологии и ветеринарии.
ПРАВИЛА РАБОТЫ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Общие
положения
Во время работы в лаборатории соблюдайте чистоту, тишину, порядок.
По окончании пользования водой и источниками энергии немед-ленно закрывайте краны и выключайте электроприборы.
Не бросайте в раковину бумагу, вату, фильтры и другие предметы.
При замеченных неисправностях электрической проводки, водо-проводной сети, лабораторной аппаратуры, тяги, приборов немедленно сообщите об этом дежурному лаборанту или преподавателю.
Запрещается посторонним лицам посещать лабораторию и отвлекать от работы студентов; работать в лаборатории одному; пить и принимать пищу.
Правила техники безопасности
Работу в лаборатории необходимо выполнять в халатах из хлоп-чатобумажной ткани, застегивающихся спереди.
Все опыты с концентрированными кислотами, щелочами, газо-образными веществами, органическими растворителями (спиртом, аце-тоном, бензином и др.) производить под тягой. При работе со щелочью надевайте защитные очки.
При работе с воспламеняющимися веществами запрещается пользо-ваться открытым огнем. Нельзя нагревать горючие жидкости на открытом огне, на сетке, вблизи открытого пламени или в открытых сосудах.
Перед разборкой приборов, в которых содержатся воспламеняющи-еся вещества, необходимо вначале выключить находящиеся поблизости нагревательные приборы (электроплитки).
Нельзя выпаривать на столах растворы, выделяющие токсичные газы (сероводород, хлор, окислы азота).
Запрещается набирать кислоты и другие агрессивные жидкости в пипетку ртом, в этом случае следует пользоваться резиновой грушей или градуированными пробирками и бюретками.
Запрещается выливать в раковину крепкие кислоты, щелочи, ор-ганические растворители, ртуть и ее соединения, сильно пахнущие ве-щества. Их собирают в отдельную посуду с надписью.
При нагревании пробирок с растворами следует держать их специальным держателем открытым концом от себя и от стоящих рядом людей. Не пользоваться пробирками с трещинами.
При нагревании жидкостей с осадком надо быть осторожным во избежание выброса из сосуда горячей реакционной массы.
Запрещается проводить опыты в грязной посуде.
При работе с химическими веществами запрещается пробовать их на вкус.
При переливании агрессивных жидкостей необходимо пользо-ваться защитными очками, перчатками и фартуком.
При измельчении твердых кусков реактивов необходимо обер-нуть их плотной тканью и пользоваться защитными очками.
Запрещается оставлять без присмотра включенные электропри-боры. 15. Работать на центрифуге, аппарате для электрофореза и другом лабораторном оборудовании разрешается после детального ознакомле-ния с его техническим описанием и инструкцией по эксплуатации.
Первая помощь при несчастных случаях
При попадании на кожу щелочи обожженное место обильно про-мывают проточной водой, а затем протирают 2%-ным раствором уксус-ной или борной кислоты.
При попадании на кожу кислоты обожженное место обильно про-мывают проточной водой, а затем протирают 2%-ным раствором амми-ака или соды.
При сильных термических ожогах кожу смачивают крепким рас-твором перманганата калия или спиртовым раствором танина, спиртом, жировой эмульсией.
При поражении электрическим током, если пострадавший остается в соприкосновении с токоведущими частями, необходимо выключить ток при помощи пускателя, либо вывернуть предохранительные пробки, либо перерубить токопроводящий провод изолированным инструментом. Пока по-страдавший находится под током, нельзя прикасаться к нему без резиновых перчаток. До прибытия врача пострадавшему делают искусственное дыхание.
Тушение местного пожара и горящей одежды
При возникновении пожара потушите очаг пожара.
При возгорании одежды тушите ее водой или перекатыванием по-страдавшего по полу.
Р а з д е л I. Б
Е
Л
К
И
Белки — важнейшая составная часть живой клетки. Основой белковых молекул являются длинные полипептидные цепи, построенные из многих аминокислотных звеньев, причем каждый белок имеет свою, характерную для него, последовательность аминокислот. Поэтому белки — очень многочис-ленные и исключительно многообразные по своим функциям биомолекулы.
Аминокислоты в полипептидных цепях белков связаны прочными ко-валентными пептидными связями. Эти связи сохраняются при воздействии на белок денатурирующими факторами, но разрушаются при гидролизе.
При формировании белковой молекулы полипептидные цепи уклады-ваются определенным образом в пространстве: свертываются в плотную компактную структуру сферической формы (глобулярные белки) или укла-дываются в виде длинных нитевидных образований (фибриллярные белки). Вторичная и третичная структуры белковых молекул стабилизиру-ются и поддерживаются различными типами взаимодействий: водород-ными связями, электростатическим притяжением между противополож-но заряженными группами, гидрофобными взаимодействиями и кова-
лентными поперечными связями (дисульфидными).
Некоторые белки имеют четвертичную структуру, то есть состоят из нескольких белковых субъединиц, объединенных в одну гигантскую молекулу.
Работа
1.
ЦВЕТНЫЕ
РЕАКЦИИ
НА
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ
Присутствие аминокислот и белков в биологических объектах можно обнаружить с помощью специфических реакций. Некоторые химические вещества дают окрашенные продукты при взаимодей-ствии с аминокислотами и белками.
Существуют универсальные реакции, которые дают все белки (би-уретовая, нингидриновая). Кроме того, имеются специфические реак-ции (ксантопротеиновая, Миллона и др.), которые обусловлены наличи-ем только определенных аминокислот в структуре белка.
На основании цветных реакций разработаны методы качественного и количественного определения аминокислот и белков.
А.
Нингидриновая
реакция
Нингидриновая реакция характерна для α-аминокислот и обуслов-лена наличием в них свободной аминогруппы. Белки, пептиды, а также свободные α-аминокислоты, дают сине-фиолетовое окрашивание при нагревании с нингидрином (индан-1, 2, 3-трионгидрат).
При нагревании белка с избытком нингидрина аминокислота окис-ляется и распадается, образуя двуокись углерода, соответствующий аль-дегид и соединение сине-фиолетового цвета (комплекс Руэмана):
Интенсивность окраски зависит от количества аминокислот в ги-
дролизатах или свободных аминогрупп в молекуле белка. Реакция ши-
роко
используется
для
обнаружения
аминокислот
при
их
хроматографи-ческом разделении (см. раб.3).
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора аминокислоты глицина и в третью —
1 мл 1%-го раствора аминокислоты β-аланина. В каждую пробирку до-бавляют по 3 капли 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают в водяной бане до кипения.
Через 2–3 мин наблюдают появление окрашивания и объясняют разницу в окраске растворов в трех пробирках.
Б.
Биуретовая
реакция
Биуретовая реакция открывает в белке пептидную связь. Эту реак-цию дают все белки, продукты их неполного гидролиза (пептоны, пепти-ды), некоторые небелковые вещества (биурет H2 N–CO–NH–CO–NH2, оксамид H2 N–CO–СО–NH2) а также свободные аминокислоты в боль-ших концентрациях (гистидин, серин, треонин, аспарагиновая кислота). Биуретовая реакция обусловлена образованием окрашенного в си-
не-фиолетовый цвет медного комплекса. Полипептид в щелочной среде претерпевает полную енолизацию:
Енольная форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди и образует стабильное комплексное соединение:
Растворимый фиолетово-синий комплекс меди с белком
Ход
работы
В пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, добавляют 2 мл 1%-го раствора гидроксида натрия и 1 мл 1%-го раствора сульфата меди, появляется сине-фиолетовое окрашивание.
В.
Ксантопро
теиновая
реакция
Реакция обнаруживает в белке ароматические аминокислоты (фени-лаланин, тирозин, триптофан).
Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание.
Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца ароматиче-ских аминокислот с образованием нитросоединений жёлтого цвета:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го раствора триптофана. В пробирки вносят по 3 капли концентрирован-ной азотной кислоты, нагревают, охлаждают и добавляют несколько ка-пель 30%-гo гидроксида натрия.
Наблюдают появление окрашивания и объясняют разницу в окра-ске в трех пробирках.
Г.
Р
еакция
на
тирозин
(реакция
Миллона)
Реакция обнаруживает в белке аминокислоту тирозин. При добав-лении к раствору белка реактива Миллона (смесь нитратов Нg+ и Нg++ в концентрированной азотной кислоте) белок выпадает в осадок, а при нагревании приобретает красный цвет.
Реакция обусловлена образованием нитросоединений тирозина,
которые,
присоединяя
ртуть,
при
нагревании
превращаются
в
сложную смесь комплексных солей нитротирозина красного цвета:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1% -го раствора тирозина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл реактива Миллона и осторожно нагревают.
Наблюдают появление окрашивания в пробирках и объясняют разницу в окраске.
Д.
Р
еакция
на
триптофан
(реакция
Адамкевича)
Реакция обнаруживает в белке аминокислоту триптофан. При до-бавлении к раствору белка незначительных количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фи-олетовое окрашивание.
Реакция основана на способности триптофана вступать в реакцию с глиоксиловой кислотой в кислой среде, образуя при этом окрашенные продукты конденсации (смолы):
Ход
рабо
ты
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го раствора триптофана. В каждую пробирку в качестве источника гли-оксиловой кислоты добавляют по 1–2 мл концентрированной уксусной кислоты (глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольших коли-чествах в ледяной уксусной кислоте).
Растворы слегка нагревают, затем охлаждают и по стенке пробир-ки осторожно, не допуская смешивания жидкости, добавляют по 2 мл концентрированной серной кислоты.
Через некоторое время в пробирке с яичным белком на границе двух слоев жидкости наблюдается красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню на 3 мин. Объясняют разницу в окраске рас-творов в трех пробирках.
Е.
Р
еакция
на
серосодержащие
аминокислоты (реакция Фоля)
Реакция Фоля открывает в белке серосодержащие аминокислоты цистин и цистеин, содержащие слабосвязанную серу. Метионин этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.
При добавлении к раствору белка крепкой щелочи, уксуснокислого свинца с последующим кипячением раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена тем, что при нагревании с крепкой щелочью цистин и ци-стеин разрушаются, образуя сульфид натрия:
Ацетат свинца взаимодействует со щелочью, образуя плюмбит натрия:
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом образует черный осадок сульфида свинца:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го рас-твора цистеина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 30%-го раствора гидроксида натрия и 1 мл 5%-го раствора ацетата свинца.
После интенсивного кипячения наблюдают появление окрашива-ния и объясняют разницу в окраске растворов в трех пробирках.
Ход и результаты всех цветных реакций на белки и аминокислоты по всем пунктам работы 1 оформляют в виде таблицы (табл. 1).
Таблица 1
№
п/п
Наименование
реакции
Исследуемый материал
и условия реакции
Наблюдаемое
окрашивание
Химизм
реакции
Контрольные
в
опросы
Назовите специфическую реакцию на α-аминокислоты. Объясните химизм этой реакции.
Какая химическая группа в белках и аминокислотах обусловлива-ет нингидриновую реакцию?
Назовите универсальную реакцию на белки. Объясните химизм этой реакции.
Какой химической группировкой в белках обусловлена биурето-вая реакция?
Какой реакцией обнаруживают ароматические аминокислоты?
Какую аминокислоту в белке открывают реакцией Миллона? ре-акцией Адамкевича? реакцией Фоля?
Объясните химизм цветных реакций на тирозин, триптофан, цистеин.
Реактивы
и
обору
дование
1. 1%-й раствор яичного белка: 1 г белка куриных яиц растворя-ют в 100 мл воды. 2. 1%-й раствор желатина. 3. 0,1%-е растворы тиро-зина, триптофана, цистеина. 4. 1%-е растворы глицина, α — аланина.
0,5%-й раствор нингидрина в 9%-ном ацетоне. 6. 10%-й раствор гидрок-сида натрия. 7. 1%-й раствор сульфата меди. 8. Концентрированная азот-
ная кислота. 9. Реактив Миллона: 200 г закисной ртути Hg2 (NO3)2 или
400 г окисной ртути Hg (NO3)2 растворяют в 1 л воды и добавля-
ют концентрированную азотную кислоту до просветления раствора.
10. Ледяная уксусная кислота. 11. Концентрированная серная кислота.
12. 30%-й раствор гидроксида натрия. 13. 5%-й раствор ацетата свинца.
14. Пробирки. 15. Пипетки. 16. Водяная баня.
Работа
2.
ГИДРОЛИЗ
БЕЛКОВ
Гидролиз связан с разрывом пептидных связей в молекуле белка и присоединением воды по месту разрыва.
Гидролиз можно осуществить при длительном кипячении белка в концентрированных растворах кислот и щелочей, а также фермента-тивным путем при температуре 37 ○С. Полный кислотный и щелочной гидролиз белка протекает за 20–24 часа, ферментативный — за 1–3 часа. При гидролизе белки вначале распадаются на полипептиды, три-
и дипептиды, а затем — на аминокислоты.
Ход
работы
В гидролизную термостойкую пробирку вносят 2 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое гидролизной пробирки осторожно перемешивают и отливают 1 мл рас-твора в чистую пробирку, которая будет являться контрольной.
Далее гидролизную пробирку закрывают воздушным холодиль-ником (резиновая пробка с длинной стеклянной трубкой) и помещают в кипящую водяную баню для проведения 2-часового гидролиза.
Через каждые 30 мин после начала гидролиза из гидролизной пробирки осторожно отливают по 1 мл гидролизата последовательно в 4 отдельные пробирки (количество отобранных проб зависит от про-должительности гидролиза). Эти 4 пробы считаются опытными.
С контрольной пробой и охлажденными под водой опытными пробами проводят биуретовую реакцию (см. работу 1, п.Б). Для этого к 1 мл исследуемого раствора добавляют 2 мл 30%-го раствора гидрок-сида натрия и 1 мл 1%-го раствора сульфата меди.
Отмечают изменение интенсивности окраски в опытных пробах по сравнению с контрольной и делают выводы.
Контрольные
в
опросы
Что такое гидролиз белков?
В чем химическая сущность гидролиза?
Какие существуют виды гидролиза?
Какие структуры белковой молекулы нарушаются при гидролизе?
Назовите промежуточные и конечные продукты гидролиза белков.
Как проводят кислотный гидролиз?
Укажите температуру и катализаторы кислотного и ферментатив-ного гидролиза.
Реактивы
и
обору
дование
1.Раствор яичного белка (яичный белок разводят водой в соотно-шении 1:5). 2. Концентрированная соляная кислота. 3. 30%-й раствор гидроксида натрия. 4. 1%-й раствор сульфата меди. 5. Гидролизная пробирка. 6. Стеклянная трубка с резиновой пробкой. 7. Водяная баня.
Пипетки на 1 и 5 мл. 9. Пробирки.
Раб
ота 3. РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Метод тонкослойной хроматографии основан на различной адсорб-ции составных частей смеси на выбранном адсорбенте. В качестве адсо-рбента используют бумагу, силикагели, крахмал, тальк, окись алюминия.
В последнее время все шире используют метод хроматографии в тонком слое пористого носителя (порошкообразного силикагеля или целлюлозы), нанесенного на стеклянную пластину или алюминиевую фольгу. Этот метод требует незначительных количеств разделяемых ве-ществ (0,01–0,005 мкг) и небольших затрат времени.
Нанесенные на силикагель аминокислоты (белковый гидролизат или смесь аминокислот-«свидетелей») при пропускании через него органи-
ческого растворителя переходят в подвижную фазу растворителя и, пе-ремещаясь вместе с ним с различной скоростью, разделяются. Скорость перемещения аминокислот зависит от химического состава аминокислот, от их способности растворяться в органическом подвижном растворителе и сорбироваться неподвижной фазой.
Для
оценки
степени
распределения
аминокислот
на
хроматограмме введен фактор разделения R
f
:
где a — расстояние между линией старта и центром пятна амино-кислоты на хроматограмме, мм;
b — расстояние между линией старта и фронтом растворителя, мм.
Чем больше растворимость аминокислот, например, в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом растворите-ля и тем больше у них величина.
На величину Rf влияет природа адсорбента и растворителя (элюента), хи-мическое строение аминокислот, температура и другие факторы. Величина Rf является характерной для каждой аминокислоты при данных условиях опыта.
Качественное определение аминокислот основано на проявлении хро-матограммы нингидрином и сравнении Rf анализируемых аминокислот с Rf известных (стандартных) аминокислот, называемых «свидетелями».
Для количественного определения аминокислот хроматографиче-ские пятна элюируют из слоя сорбента полярным растворителем, изме-ряют оптическую плотность окрашенных растворов и по калибровочно-му графику находят содержание аминокислот в исследуемом гидролиза-те или смеси аминокислот (см. работу 12).
Устройство
для
тонкослойной
хроматографии
представлено
на рис. 1.
Рис.
1.
Устройство
для
тонкослойной
хроматографии
Ход
работы
Нанесение аминокислот на хроматографическую пластину.
Для тонкослойного хроматографирования берут силуфоловую пла-стинку, представляющую собой алюминиевую фольгу, на которую нане-сен тонкий слой высокопористого активированного силикагеля.
Поперек пластинки, на расстоянии 1–1,5 см от ее узкого края прово-дят карандашом тонкую сплошную линию старта, стараясь не повредить слой силикагеля. На линии старта карандашом отмечают точки нанесе-ния растворов аминокислот на расстоянии около 1 см одна от другой.
В первую точку наносят стеклянным капилляром 1–2 мкл спиртово-го раствора, содержащего смесь аминокислот с концентрацией каждой аминокислоты, равной 0,01 М. В остальные точки разными капилляра-ми наносят последовательно по 1–2 мкл стандартных спиртовых раство-ров известных аминокислот («свидетелей»). Пластинку подсушивают на воздухе до полного испарения растворителя.
Хроматографическое разделение аминокислот.
Край пластинки, на который нанесены растворы аминокислот, опуска-ют в растворитель (смесь бутанола, уксусной кислоты и воды), налитый на дно хроматографической камеры так, чтобы линия старта была выше уровня растворителя. Пластинку устанавливают в камере в наклонном по-ложении, затем герметически закрывают камеру пришлифованной крыш-кой. Растворитель в течение 20–40 мин обычно поднимается до верхнего края пластинки, увлекая за собой растворенные в нем аминокислоты.
Разделение можно считать законченным, когда растворитель прой-дет 2/3 длины пластинки. Пластинку вынимают из камеры и подсушива-ют на воздухе (под тягой) 5–10 мин до исчезновения паров растворителя.
Проявление хроматограммы.
Аминокислоты на хроматограмме проявляют, используя нинги-дриновую реакцию (см. работу 1, п.А). Для этого пластинку или опры-скивают 0,1%-ным раствором нингидрина в ацетоне из пульверизатора и помещают в сушильный шкаф с температурой 105 ○C на 5 мин, или порошок нингидрина насыпают в хроматографическую камеру в смесь растворителей перед началом хроматографического разделения. После окончания разделения пластинку вынимают, cлегка подсушивают на воз-духе и помещают в сушильный шкаф с температурой 105 ○C на 5 мин.
Аминокислоты анализируемой смеси и «свидетели» проявляют-ся в виде сине-фиолетовых пятен. Некоторые аминокислоты (пролин, оксипролин) при взаимодействии с нингидрином дают желтые пятна. Интенсивность окраски пятен зависит от концентрации аминокислот.
Качественное определение аминокислот.
Полученную хроматограмму зарисовывают, указывая на ней прояв-ленные аминокислоты.
Сравнивают расстояние, пройденное каждой исследуемой амино-кислотой смеси, с расстоянием, пройденным каждым «свидетелем».
Определяют Rf каждой исследуемой аминокислоты и «свидетеля» по формуле (1). Для этого с точностью до миллиметра линейкой изме-ряют расстояние, пройденное каждой аминокислотой и растворителем
от линии старта до центра пятна.
Сопоставляют Rf величины аминокислот исследуемой смеси и ами-нокислот-«свидетелей» и делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси.
