Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус

Исследование чувствительности штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных МВ в Российской Федерации, с помощью тест-системы АТВ и диско-диффузионным методом показало, что 100% штаммов P. aeruginosa были чувствительны к колистину, 85,5% – к цефтазидиму, 82% – к меропенему, 71% штаммов – к имипенему, азлоциллину, левофлоксацину и тобрамицину, 75% штаммов – к офлоксацину и ципрофлоксацину, 97% – к пиперациллину + тазобактаму, 92% – пиперациллину [14].

82% штаммов P. aeruginosa были устойчивы к ампициллину-сульбактаму, 79% – к ко-тримоксазолу, 79% – к цефотаксиму, 62,5% – к цефтриаксону и 83% – к левомицетину.

Однако при аэрозольном пути доставки антибиотиков лекарственное средство попадает непосредственно в просвет бронхов. При этом в бронхиальном секрете создаются высокие концентрации препарата при низком их уровне в сыворотке крови, что дает дополнительные возможности для преодоления часто наблюдаемой при МВ антибиотикорезистентности. Так, применение тобрамицина для ингаляций у больных МВ оправдано с точки зрения доказательной медицины и рекомендовано международными и отечественными руководствами по лечению инфекции легких, вызванной Pseudomonas aeruginosa.

Идентификация и дифференциация бактерий Burkholderia cepacia complex

Идентификация бактерий комплекса Bcc является многоэтапной и единственной в практике, где необходима комбинация фенотипических и генотипических методов, т.е. использование поли-фазного таксономического подхода. На 1-м этапе для выделения Bcc из образца осуществляют посев на селективную среду. Для выделения бактерий комплекса Bcc из мокроты больных МВ наиболее оптимальным является BCSA (Burkholderia cepacia complex selective agar) – агар, содержащий 1% лактозы, 1% сахарозы на обогащенной основе казеина и дрожжевого экстракта с добавлением 600 ЕД/мл полимиксина В, 10 мкг/мл гентамицина и 2,5 мкг/мл ванкомицина. На этой среде растут преимущественно бактерии комплекса Bcc, но наряду с ними могут расти B. gladioli, виды Ralstonia и S. maltophila. После выделения бактерий на селективной среде необходимо осуществить их идентификацию с помощью молекулярно-генетических методов. Могут использоваться и другие дополнительные тесты: определение гемолитической, протеазной активности, способности образования биопленки. На современном этапе для типирования используется метод мультилокусного секвенирования и секвенирования генома [3, 14, 17, 18].

Устойчивость к антимикробным препаратам

Из анализа антибиотикограмм штаммов Bcc [36], выделенных от 67 больных детей от 5 до 17 лет и от 38 взрослых больных, в процессе динамического наблюдения выявлено, что все штаммы являются мультирезистентными. Установлено, что абсолютно все штаммы резистентны к амикацину, гентамицину, тобрамицину и имипенему. К ко-тримоксазолу резистентны 88,6%, к хлорамфениколу – 58,7%, к цефепиму – 80,8%, к цефоперазону – 76,5%, к ципрофлоксацину – 85,5%, к цефтриаксону – 60,8%. Низкий процент резистентности был выявлен по отношению к меропенему и цефтазидиму – 14,1 и 17,9% соответственно, 71,8% штаммов были чувствительны к цефтазидиму, 56,4% – к меропенему, 90,9% штаммов Всс были чувствительны к комбинированному антибиотику пиперациллину-тазобактаму. При исследовании чувствительности к антимикробным препаратам также установлено, что все штаммы полирезистентны к 5 антибиотикам: имипенему, ко-тримоксазолу, тобрамицину, гентамицину и амикацину, что может свидетельствовать об их госпитальном происхождении. Таким образом, можно сделать заключение, что в процессе лечения штаммы приобретают устойчивость к антимикробным препаратам, что делает возможным длительную персистенцию микроорганизма и препятствует эрадикации возбудителя. Надо отметить, что данные антибиотикограмм, полученные в результате исследования in vitro, могут не отражать «истинной» чувствительности возбудителя в условиях in vivo. Тест определения антибиотикочувствительности может зависеть как от свойств самого возбудителя, в т.ч. и от способности образовывать биопленку, так и от условий его культивирования. Зарубежными авторами [37] было показано, что при исследовании 101 образца мокроты из каждого образца было выделено по 4 морфотипа колоний одного генотипа P. aeruginosa. Среди одного морфотипа практически каждая колония имела антибиотикограмму, отличную от других колоний одного морфотипа. 48 колоний P. aeruginosa, выделенных из одного образца мокроты, имели различные антибиотикограммы. Однако приведенные выше данные не отрицают, а подтверждают необходимость постоянного мониторинга антибиотикочувствительности штаммов микроорганизмов у больных МВ.

Точная идентификация НФМО от больных МВ является наиболее сложной задачей. Очень часто нетипичные по фенотипическим свойствам микроорганизмы ошибочно могут диагностироваться как другие виды микроорганизмов. Ложная идентификация P. aeruginosa или Bcc может иметь нежелательные последствия, ведущие к выбору неправильной терапии и изоляции пациентов.

Например, в проведенном исследовании [14] два штамма атипичной P. aeruginosa и два штамма A. xylosoxidans были неправильно идентифицированы API 20NE как Всс, 12 штаммов Bcc биохимическими тестами (LaChema) были неправильно идентифицированы как другие НФМО. Около 3,4% штаммов биохимическими тестами не удалось идентифицировать вообще. Для окончательной точной идентификации были использованы молекулярно-генетические методы. Kiska et al. показали в своей работе, что точность идентификации НФМО четырьмя различными коммерческими тест-системами составляет 57-80%, а точность идентификации Всс – 43-86%. При этом все тесты идентифицировали НФМО, не являющиеся Всс, как Всс [25].

В связи с этим методы, основанные на ПЦР, в частности ПЦР-real-time, могут быть незаменимыми в сложных ситуациях.

Для точной идентификации Всс необходимо соблюдать следующую схему:

• посев мокроты на 5% кровяной агар, BCSA с дальнейшим выделением чистой культуры;

• исследование чистой культуры молекулярно-генетическими методами: ПЦР на recA-ген [16];

• исследование мокроты молекулярно-генетическими методами [26];

• в настоящее время могут использоваться MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorbtion-Ionization Time of Flihgt), масс-спектрометрия.

Идентификация Achromobacter spp.

Очень часто A. хylosoxidans, A. ruhlandii ложно диагностируют как Всс в связи с фенотипическим сходством с Bcc при культивировании на 5% кровяном агаре и ростом на BCSA – селективной для Всс среде. Для подтверждения принадлежности бактерии к виду A. хylosoxidans необходимо использовать тест-системы API 20 NE (BioMerieux) и ПЦР для выявления локуса в 16S рДНК со специфическими праймерами AX-F1 и AX-B1 [14, 27].

Идентификация анаэробной инфекции

В результате процессов в легких при МВ, приводящих к нарушению мукоцилиарного очищения, нарушается газообмен в легких и могут создаваться анаэробные условия, что способствует возникновению анаэробной инфекции. Исследования показали [14], что причиной легочной инфекции могут быть также анаэробные микроорганизмы. У 2 детей классические бактериологические методы не позволили идентифицировать возбудителя легочной инфекции. При исследовании мокроты с помощью ПЦР-real-time были выявлены анаэробные микроорганизмы. Для выращивания и идентификации анаэробов необходимы специальные анаэробные условия (анаэростат). При отсутствии анаэростата методом выбора является ПЦР-real-time, используя которую идентификация анаэробов возможна непосредственно в мокроте.

4.3. Эпидемиология хронической респираторной инфекции у больных муковисцидозом

Источник инфекции

Около 40% здоровых людей являются носителями S. aureus на передней поверхности носовых ходов и на коже. В связи с этим важным источником хронической инфекции, вызванной золотистым стафилококком, могут быть здоровые лица, включая медперсонал, членов семей больных МВ, и лица, с которыми общается больной МВ. Источником инфекции может быть также воздух медицинских палат, жилых комнат, в которых может циркулировать S. aureus. Особую опасность представляют метициллин-устойчивые штаммы золотистого стафилококка (MRSA), которые свидетельствуют, с одной стороны, о приобретении больными таких штаммов, вероятнее всего, в больнице, а с другой – о проблеме выбора антимикробных препаратов для лечения хронической инфекции, так как MRSA, как правило, устойчивы ко многим антибиотикам [28]. Сообщается о возможности передачи MRSA пациентам с МВ от лиц без МВ (например, медперсонала, родственников) или других пациентов с МВ. По данным российских исследователей [14], среди штаммов S. aureus, выделенных из мокроты больных с МВ, доля MRSA составляет около 20%. Предварительные результаты молеклярно-генетического типирования свидетельствуют о том, что определенная часть штаммов MRSA являются внутрибольничными штаммами, тогда как другие, вероятно, имеют внегоспитальное происхождение. Инфицирование внутрибольничными штаммами свидетельствует о том, что госпитализация, хирургические вмешательства, использование катетеров могут быть факторами риска развития хронической респираторной инфекции у больных МВ.

P. аeruginosa также присутствует на коже 10-20% здоровых носителей, которые могут быть источником хронической инфекции у больных МВ, вызванной данным микроорганизмом [29-31]. Однако не исключается и возможность заражения больного в результате контактов с растениями и плодами, которые могут быть колонизированы синегнойной палочкой. Загрязненные водные источники, сточная система стационаров (раковины, туалеты, душевые), медицинские устройства, содержащие воду, могут быть резервуарами P. aeruginosa и приводить к инфицированию легких больных МВ. Установленная в некоторых исследованиях идентичность штаммов в водопроводной воде и у больных подтверждает возможность передачи бактерий из водопровода пациентам и наоборот. В стационарах не исключается роль рук медицинского персонала, а также воздуха палат в колонизации легких больных МВ [32-35]. Таким образом, инфицирование P. aeruginosa происходит как прямым, так и непрямым контактным и воздушно-капельным путем. Госпитализация, контакты с больными МВ, инфицированными P. aeruginosa, медицинское оборудование, контаминированное P. aeruginosa, создают возможности для инфицирования больных МВ. В воде, как и во многих растворах, применяемых в медицине, P. aeruginosa может сохраняться до 1 года при комнатной температуре. Вода в бассейнах, загрязненная возбудителем, является идеальной средой для размножения P. aeruginosa и быть источником для заражения. При молекулярно-генетическом типировании P. aeruginosa выявлены как достаточно значительные идентичные геногруппы, так и отдельные генотипы штаммов P. aeruginosa, что свидетельствует о разнообразии источников заражения больных, в т.ч. в госпитальных условиях.

Бактерии Bcc, насчитывающие в настоящее время 20 видов, обитают в почве и растениях. Они вызывают заболевание – гниль у лука. Их распространение во внешней среде, связанной с обитанием человека, остается недостаточно изученным. Бактерии Bcc иногда выявляют в клиниках у больных с раневой инфекцией, но определенную тропность они имеют у больных МВ и выделяются от больных с хронической инфекцией в 3-5% случаев, а в нашей стране чаще, и у госпитализированных больных в 55% случаев. По результатам многолетних исследований в отделении педиатрии РДКБ можно полагать, что передача B. cepacia сomplex в стационаре осуществляется от пациента к пациенту и что хроническая инфекция, вызванная данным возбудителем, является типичной внутри-больничной инфекцией в связи с тем, что в стационаре постоянно выявляется один генотип и прослеживается клональность штамма B. cenocepacia – геномовара 3А [4, 17, 18].

В целом выявление источников, путей передачи и резервуаров инфекции представляет собой трудную задачу, так как требует проведения постоянного мониторинга, требующего высокой квалификации микробиологов, эпидемиологов и лечащих врачей. Однако наиболее вероятными источниками инфекции являются пациенты с хронической инфекцией, особенно смешанной, вызванной несколькими видами микророрганизмов (перекрестная инфекция), контакты больных МВ со здоровыми носителями S. aureus, P. aeruginosa, и здесь наиболее значимыми и опасными являются носители среди медперсонала и родственники, с которыми постоянно контактируют больные, а также воздух и предметы окружающей среды, которые могут быть обсеменены микроорганизмами постоянно или временно. Вероятность передачи инфекции повышается во время пребывания больного в стационаре, где находятся другие пациенты с хронической инфекцией, в связи с этим оптимальным является лечение таких больных в индивидуальных палатах.

Литература

1. Шагинян И.А., Капранов Н.И., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Семыкин С.Ю., Аветисян Л.Р., Каширская Н.Ю., Пивкина Н.В., Данилина Г.А., Батов А.Б., Бусуек Г.П. Микробный пейзаж нижних дыхательных путей у различных возрастных групп детей, больных муковисцидозом. ЖМЭИ. 2010; 1: 15-20.

2. Hauser A.R., Jain M., Bar-Meir M., McColley S.A. Microbes and outcomes in cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 2011; 24: S.1-70.

3. Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Капранов Н.И., Алексеева Г.В., Каширская Н.Ю., Аветисян Л.Р., Семыкин С.Ю., Данилина Г.А., Поликарпова С.В., Пивкина Н.В. Персистенция Burkholderia cepacia complex у больных муковисцидозом. ЖМЭИ. 2012; 4: 93-98.

4. Шагинян И.А., Капранов Н.И., Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Семыкин С.Ю., Аветисян Л.Р., Каширская Н.Ю., Пивкина Н.В., Данилина Г.А., Батов А.Б., Бусуек Г.П. Особенности микрофлоры нижних дыхательных путей у различных возрастных групп детей, больных муковисцидозом: Сборник «Муковисцидоз в России (20 лет Российскому центру муковисцидоза)». Материалы Х Национального конгресса «Муковисцидоз у детей и взрослых». Ярославль, 2011: 64-71.

5. Demco C.A., Stern R.C., Doershuk C.F. Stenotrophomonas maltophilia in cystic fibrosis: incidence and prevalence. Pediatr. Pulmonol. 1998; 25: 304-308.

6. Liu L., Coenye T., Burns J.L., Whitby P.W., Stull T.L., LiPuma J.J. Ribosomal DNA-directed PCR for identification of Achromobacter (Alcaligenes) xylooxidans recovered from sputum samples from cystic fibrosis patients. J. Clin. Microdiol. 2002; 40: 1210-1213.

7. Govan J.R.W., Baklandreau J., Vandamme P. Burkholderia cepacia complex – Friend anf Foe. ASM News. 2000; 66: 124-125.

8. Takahashi T., Satoh I., Kikuchi N. Phylogenetic relationships of 38 taxa of the genus Staphylococcus based on 16S rRNA gene sequence analysis. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999; 2 (49): 725-728.

9. Saiman L., Siegel J. Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient- to-patient transmission. Infection control and hospital epidemiology. 2003; 24 (5) (Suppl.): 1-52.

10. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Неферментирующие грамотрицательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности. Клиническая микробиология и антимикробная химотерапия. 2005; 7 (3): 271-285.

11. Gilligan P.H., Lum G., Vandamme P.A.R., Whittier S. Burkholderia, Stenotrophomonas, Ralstonia, Brevundimonas, Comamonas, Delftia, Pandorea, and Acidovorax. In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington: ASM Pres, 2003: 729-748.

12. Kiska D.L., Gilligan P.H. Pseudomonas. In: Manual of Clinical Microbiology Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., eds.. 8th ed. Washington: ASM Press, 2003: 719-728.

13. Schreckenberger P.C., Daneshvar M.I., Weyant R.S., Hollis D.G. Acinetobacter, Achromobacter, Chryseobacterium, Moraxella, and other nonfermentative gram-negative rods. In: Manual of Clinical Microbiology. Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., eds. 8th ed. Washington: ASM Press, 2003: 749-779.

14. Чернуха М.Ю., Аветисян Л.Р., Шагинян И.А., Алексеева Г.В., Авакян Л.В., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Семыкин С.Ю., Сиянова Е.А, Медведева О.С., Красовский С.А., Усачева М.В., Кондратьева Е.И., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Алгоритм микробиологической диагностики хронической инфекции легких у больных муковисцидозом. Клиническая микробиология и антимикробная химотерапия. 2014; 16 (4): 276-290.

15. Sousa S.A., Ramos C.G., Leitão J.H. Burkholderia cepacia complex: Emerging Multihost Pathogens Equipped with a Wide Range of Virulence Factors and Determinants. Int. J. Microbiol. 2011;

16. Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А. Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia complex c помощью ПЦР. В кн.: Учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии». А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, ред. М., 2006; раздел 2.7: 117-126.

17. Воронина О.Л., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Кунда М.С., Аветисян Л.Р., Орлова А.А., Лунин В.Г., Капранов Н.И., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Характеристика генотипов штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных от больных в стационарах Российской Федерации. Молекулярная генетика. 2013; 2: 22-30.

18. Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Романова Ю.М., Степанова Т.В., Батов А.Б., Гинцбург А.Л. Исследование вирулентных свойств госпитальных штаммов бактерий комплекса B. сepacia, выделенных в стационарах города Москвы. ЖМЭИ. 2005; 6: 46-51.

19. Kilby J.M., Gilligan P.H., Yankaskas J.R., Highsmith W.J., Edwards L.J., Knowles M.R. Nontuberculous mycobacteria in adult patients with cystic fibrosis. Chest. 1992; 102: 70-75.

20. Olivier K.N., Handler A., Less J.H., Tudor J., Knowles M.R. Clinical impact of nontuberculous mycobacteria on the course of cystic fibrosis lung desease: results of multicenter nested cohort study. Pediatr. Pulmonol. 2000:102-103.

21. Group Cystic Fibrosis Trust Microbiology Laboratory Standards Working. Laboratory Standards For Processing Microbiological Samples From People With Cystic Fibrosis. Report of the UK Cystic Fibrosis Trust Microbiology Laboratory Standards Working Group, September 2010.

22. Wellinghausen N., Köthe J., Wirths B., Sigge A., Poppert S. Superiority of molecular techniques for identification of Gram-negative, oxidase-positive rods, including morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa, from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4070-4075.

23. Шагинян И.А., Дмитренко О.А. Молекулярная эпидемиология внутрибольничных инфекций, вызываемых метициллинустойчивыми стафилококками. ЖМЭИ. 2003; 3: 99-109.

24. Sadikot R.T., Blackwell T.S., Christman J.W., Prince A.S. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005 Jun 1; 171 (11): 1209-1223.

25. Kiska D.L., Kerr A., Jones M.C., Caracciolo J.A., Eskridge B., Jordan M., Miller S., Hughes D., King N., Gilligan P.H. Accuracy of four commercial systems for identification of Burkholderia cepacia complex and other Gram-negative non-fermenting bacilli recovered from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 886-891.

26. Воронина О.Л., Кунда М.С., Аксенова Е.И., Орлова А.А., Чернуха М.Ю., Лунин В.Г., Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., Гинцбург А.Л. Экспресс-диагностика микроорганизмов, поражающих дыхательные пути больных муковисцидозом. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 11: 53-58.

27. Lambiase A., Catania M.R., Del Pezzo M., Rossano F., Terlizzi V., Sepe A., Raia V. Achromobacter spp. respiratory tract infection in cystic fibrosis patients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011 Aug; 30 (8): 973-980.

28. Givney R., Vickery A., Holliday A., Pegler M., Benn R. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a cystic fibrosis unit. J. Hosp. Infect. 1997; 35: S27-36.

29. Cheng K., Smith R.L., Govan J.R., Doherty C., Winstanlty C., Denning N., Heaf D.P., van Saene H., GHart C.A. Spread of beta-lactam-resistant Pseudomonas aeruginosa in a cystic fibrosis clinic. Lancet. 1996; 348: S. 639-642.

30. Doring G., Jansen S., Noll J., Grupp H., Frank F., Botzenhart K. Magdorf K., Wahn U. Dictribution and transmission of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia complex in a hospital ward. Pediatr. Pulmonol. 1996; 21: S90-100.

31. Jones A.M., Govan J.R.W., Dohorty C.J., Dodd M.E., Isalska B.J., Stanbridge T.N., Webb A.K. Identification of airborne dissemination of eptidemic multiresistant strains of P. aeruginosa st a CF centre during a crossinfection outbreak. Thorax. 2003; 58: 525-527.

32. Munck A., Bonacorsi S., Mariani-Kikdjian P., Lebourgeois M., Gerardin M., Brahimi N., Navarro J., Bingen E. Genotypic characterization of Pseudomonas aeruginosa strains recovered from patients with cystic fibrosis after initial and subsequent cokonization. Pediatr. Pulmonol. 2001; 32: S. 288-292.

33. Saiman L., Siegel J. Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient-to-patient transmission. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2003; 24 (Suppl.): 6-52.

34. Speert D.P., Campbell M.E. Hospital epidemiology of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibriosis J. Hosp. Infect. 1987; 9: 11-21.

35. Witchurh C.B., Tolker-Nielsen T., Ragas P.C., Mattick J.S. Eхtracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science. 2002; 295: 1487.

36. Чернуха М.Ю., Аветисян Л.Р., Шагинян И.А., Алексеева Г.В., Авакян Л.В., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Пивкина Н.В., Поликарпова С.В., Кондратьева Е.И., Семыкин С.Ю., Усачева М.В., Красовский С.А., Амелина Е.Л. Фенотипические и генотипические особенности штаммов бактерий Burkholderia cepacia complex, выделенных от больных муковисцидозом. Педиатрия. 2014; 93 (4): 24-31.

37. Foweraker J., Laughton C.R., Brown D.F.J., Bilton D. Phenotypic variability of Pseudomonas aeruginosa in sputa from patients with acute infective exacerbation of cystic fibrosis and its impact on the validity of antimicrobial susceptibility testing. J. Antimicrobial Chem. 2005; 55: 921-927.

38. Gold R., Jin E., Levison H., Isles A., Fleming P.C. Ceftazidime alone and in combination in patients with cystic fibrosis: lack of eficacy in treatment of severe respiratory infections caused by Pseudomonas cepacia. J. Antimicrob. Chemother. 1983 Jul; 12 (Suppl. A): 331-336.

39. Lee T. W., Brownlee K.G., Conway S.P. et al. Evaluation of a new definition for chronic Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis patients. J. Cyst. Fibros. 2003; 2: 29-34.