Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус

4. Микробиология и эпидемиология хронической респираторной инфекции при муковисцидозе

Введение

Хроническая инфекция нижних дыхательных путей (НДП) – ключевой признак у больных муковисцидозом (МВ). Она является ведущим фактором, определяющим тяжесть клинического течения и прогноз заболевания. При изучении микрофлоры НДП в различных возрастных группах детей, больных МВ, исследователями разных стран установлено, что основными возбудителями инфекции легких у больных МВ являются Р. aeruginosa, S. aureus и H. influenzae. Показано [1, 2], что в первые годы жизни у больных МВ доминирует золотистый стафилококк, а затем основным возбудителем становится синегнойная палочка. При анализе данных микробиологических исследований установлено, что условно-патогенные микроорганизмы выделяются у 61,9% детей в возрасте до 1 года, у 92,9% – в возрасте 1-4 лет, у 93,8% – в возрасте 5-7 лет и в возрасте 8-18 лет – у 100% детей. Это свидетельствует о том, что колонизация легких больных МВ микроорганизмами начинается фактически с первых дней после рождения и достигает максимума уже к 5 годам жизни. При этом если в группе детей до 1 года S. aureus выявляется только у 28,6%, а P. aeruginosa – у 19%, то в возрасте 5-7 лет золотистый стафилококк обнаружен у 87,5%, а P. aeruginosa – у 31,2%. Таким образом, в возрасте до 1 года более чем у 1/3 больных МВ НДП еще не обсеменены микроорганизмами, в возрасте 1-4 лет НДП обсеменены почти у всех больных (92,9%), а к 8-18 годам – у 100% больных. Хроническая стафилококковая, синегнойная или смешанная инфекция начинает диагностироваться у 25% детей уже в возрасте 1-4 лет, в возрасте 5-7 лет – у 50% больных, в возрасте 8-14 лет – у 65% и к 18 годам – у 80% больных МВ [3, 4].

В последнее десятилетие очевидную клиническую значимость приобретают недостаточно изученные микроорганизмы – неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФМО) – Вurkholderia cepacia complex (Bcc), Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter ruhlandii, нетуберкулезные микобактерии, грибы рода Aspergillus. При этом каждый патоген способен вызвать воспаление, которое может в той или иной степени привести к повреждению дыхательных путей, снижению легочной функции, ухудшению клинического статуса.

Согласно международным рекомендациям, о хронической инфекции, вызванной P. aeruginosa, может свидетельствовать идентификация патогена в течение двух и более раз за последние 6 месяцев. Аналогичными критериями можно руководствоваться при выявлении у больного в монокультуре S. aureus и Bcc, а также смешанной инфекции. С практической точки зрения приемлемыми являются и критерии, предложенные Lee et al. в 2003 г. [39], согласно которым обнаружение патогена более чем в 50% образцов мокроты или смывов в течение предшествующих 12 месяцев может трактоваться как хроническая инфекция.

Установлено, что в 2/3 случаев хроническая инфекция легких вызывается не монокультурой, а ассоциацией микроорганизмов, причем у госпитализированных больных, в отличие от амбулаторных больных, эти ассоциации представлены, как правило, не двумя, а тремя и более видами микроорганизмов. За рубежом [8, 9] эти показатели в 2 раза ниже: в 35% исследуемых образцов бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) выявляют рост двух микроорганизмов, и в 10% случаев ассоциации представлены тремя и более видами микроорганизмов. По данным российских авторов [3, 4], наиболее часто встречающейся ассоциацией является сочетание P. aeruginosa + S. aureus (18,2%), а также P. aeruginosa + Bcc (9,1%). В 18% случаев от больных в составе микробных ассоциаций выделяли одновременно P. aeruginosa мукоидного и немукоидного фенотипов. В составе ассоциаций кроме P. aeruginosa часто выделяли других представителей НФМО – [5, 6], что, вероятно, обусловлено тропизмом этих видов микроорганизмов к легочной ткани. Полученные данные послужили основанием для заключения, что у больных МВ характерным проявлением инфекционных осложнений является смешанная инфекция и что Bcc является типичным представителем госпитальной микрофлоры [3, 7].

Таким образом, при анализе микрофлоры больных МВ можно утверждать, что с увеличением возраста у больных формируются постоянные очаги хронической легочной инфекции, основными возбудителями которой являются P. aeruginosa и S. aureus.

Особенностью бактерий P. aeruginosa, S. aureus и Bcc, Achromobacter spp. является устойчивость ко многим антибиотикам.

4.1. Микробиологические свойства основных возбудителей хронической респираторной инфекции при муковисцидозе

Микроорганизмы, инфицирующие больного МВ, определяют лечение, качество жизни, перспективы для трансплантации и общую выживаемость. Точная и своевременная идентификация возбудителей инфекций дыхательных путей имеет существенное значение для обеспечения своевременного начала лечения соответствующими антибиотиками в целях элиминации бактериальных патогенов и организации надлежащего инфекционного контроля для профилактики распространения патогенных микроорганизмов среди больных МВ. Ниже приведены основные микробиологические характеристики доминирующих возбудителей хронической респираторной инфекции и представлен алгоритм ее микробиологической диагностики.

Staphylococcus aureus

В настоящее время род Staphylococcus, относящийся к семейству Micrococcus, включает 45 видов [8]. Вид S. aureus – золотистый стафилококк – является одним из значимых патогенов для пациентов с МВ. Он вызывает хроническую инфекцию легких, приобретаемую в обществе и во время лечения в госпитальных условиях [9].

Бактерии S. aureus представляют собой грамположительные неподвижные кокки, при микроскопии располагающиеся в виде характерных скоплений – гроздей. Стафилококки не образуют спор, но могут образовывать капсулы. У больных МВ могут выделяться 3 морфологических типа колоний – мукоидные, немукоидные и с SCV (small-colony varients)-фенотипом [9]. SCV-фенотип представляет собой мелкие, без гемолиза и пигмента, медленно растущие колонии на 5% кровяной и шоколадной плотных агаризованных средах.

Особое значение для больных МВ имеют метициллин-устойчивые стафилококки (MRSA), которые обладают устойчивостью ко многим антибиотикам. МRSA обнаруживаются во многих больницах большинства стран мира. MRSA распространяются от человека к человеку, обычно с рук медперсонала [23]. Однако могут встречаться и другие механизмы передачи, например воздушно-капельный. Некоторые штаммы являются чрезвычайно трансмиссибельными, распространяясь внутри палат, между палатами и из больницы в больницу [23].

Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы

Среди возбудителей хронической инфекции легких у больных МВ значимое место занимают НФМО, общими признаками которых являются природная устойчивость ко многим антибиотикам, высокая резистентность к дезинфектантам и распространение в больничных стационарах от больного к больному [10]. НФМО, наиболее часто вызывающие инфекции, принадлежат к нескольким родам и условно могут быть разделены на оксидазоположительные – роды Pseudomonas (кроме видов P. luteola и P. oryzihabitans), Burkholderia, Moraxella, Chryseobacterium – и оксидазоотрицательные – роды Stenotrophomonas, Acinetobacter, Bordetella (кроме B. pertussis, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii) [11-13].

Большинство из упомянутых выше родов и видов НФМО обладают высокой степенью фенотипического и генотипического родства с бактериями рода Pseudomonas, и многие из них еще в 90-х гг. прошлого века относились к данному роду. Все эти микроорганизмы могут быть выделены из окружающей среды, однако клинической значимостью характеризуются только отдельные виды некоторых родов.

Pseudomonas aeruginosa

Первоначальная классификация рода Pseudomonas, состоящего из пяти соответствующих rRNA-групп, подверглась радикальному пересмотру, закончившемуся изменением классификации многих видов рода Pseudomonas и объединением в отдельные роды. Эти роды включают Burkholderia, Stenotrophomonas, Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax и Brevundimonas. Род Pseudomonas (sensu stricto) включает соответствующую rRNA-группу 1 и объединяет 11 видов: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. veronii, P. monteilii, P. stutzeri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. luteola, P. oryzihabitans.

Псевдомонады являются аэробными неспорообразующими грамотрицательными палочками, которые могут быть прямыми или слегка изогнутыми. Они имеют от 1,5 до 5 мкм в длину и от 0,5 до 1,0 мкм в ширину и обладают строгим дыхательным метаболизмом с использованием кислорода как конечного акцептора электронов. Некоторые изоляты могут расти в анаэробных условиях с использованием нитратов или аргинина в качестве конечных акцепторов электронов. Псевдомонады подвижны благодаря присутствию одной или более полярных флагелл. Клинические изоляты являются оксидазоположительными (за исключением P. luteola, P. oryzihabitans) и каталазоположительными, а также растут на агаре МакКонки как лактозонегативные колонии [12].

Псевдомонады широко распространены в природе с преимущественным обитанием в окружающей среде, связанной с водой. Они обнаружены в воде, почве, на растениях, включая овощи и фрукты. Ввиду способности выживать в водной среде эти микроорганизмы, особенно P. aeruginosa, стали одной из основных проблем в качестве возбудителей госпитальных инфекций [12]. Бактерии P. aeruginosa являются ведущей причиной нозокомиальных инфекций дыхательного тракта. Особое значение имеют для больных МВ. Основную роль в патогенезе инфекции легких у больных МВ играют мукоидный фенотип P. aeruginosa и воспалительные реакции больного [1, 9, 14].

Бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc)

Бактерии Bcc – это группа грамотрицательных, неспоробразующих бактерий. В мазках, окрашенных по Граму, эти микроорганизмы представляют собой полиморфные прямые грамотрицательные палочки размером 0,5-1,0 х 1,5-5 мкм. После культивирования на 5% кровяном агаре при t = 30 °C в течение 48 ч бактерии Bcc образуют серые гладкие колонии с ровными краями размером 1-2 мм с резким характерным запахом гнили. При наличии пигмента колонии могут быть окрашены в желтый цвет различной интенсивности. Вокруг колоний могут образовываться зоны гемолиза. На средах Эндо и МакКонки колонии Bcc размером 1 мм окрашены в светло-розовый цвет (лактозонегативные).

В настоящее время вид B. cepacia sensu lato включает 20 близкородственных геномоваров.

Таблица 1. Представители Burkholderia cepacia complex

Все геномовары могут выделяться от больных МВ, однако преобладающим является геномовар III – B. cenocepacia, обнаруженный в 70% случаев инфекции, вызванной Bcc, в Англии, Бельгии, США, Канаде [15].

В России от больных МВ, а также при исследовании образцов от больных с пневмонией в отделениях интенсивной терапии различных клиник города Москвы также были выявлены бактерии Bcc, преимущественно принадлежащие к геномовару IIIA – B. cenocepacia [14, 16].

Клиническое значение бактерий Bcc и патогенез вызванной ими инфекции

О колонизации легких Bcc у больных МВ впервые сообщено в начале 1970-х гг. [38]. Приблизительно у 20% больных, колонизированных Bcc, возникал так называемый «сепация-синдром», характеризующийся некротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией, увеличением СОЭ и лейкоцитозом, который приводил к быстрому летальному исходу. Было высказано предположение, что появление Bcc является основной причиной неблагоприятного исхода у больных МВ. В настоящее время установлено, что Bcc представляет особую опасность для больных МВ. Хроническая микробная колонизация дыхательных путей ведет к развитию легочной инфекции – основной причины прогрессирования бронхолегочного процесса и смертности у больных МВ. Установлено, что особенностью инфекции при МВ является персистенция ассоциаций микроорганизмов в 59,4% случаев. Особенностью персистенции штаммов Bcc является тяжелое течение в виде смешанной инфекции в ассоциации с бактериями P. aeruginоsa. Бактерии Bcc, способные персистировать у больных МВ, характеризуются устойчивостью ко многим антибиотикам. Доказана длительная (до 1 года 5 мес) персистенция штаммов Bcc, выделенных от одного больного, с помощью мониторинга микрофлоры НДП. Штаммы Bcc, колонизируя НДП больных МВ, способны длительно персистировать и передаваться от пациента к пациенту [3, 17, 18].

Другие, более редко встречающиеся возбудители хронической респираторной инфекции –

Achromobacter xylosoxidans и Achromobacter ruhlandii

Род Achromobacter в настоящее время включает 15 видов и 7 генетических групп.

А. xylosoxidans, A. ruhlandii – оппортунистические патогены, оксидазо- и каталазоположительные грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы. Обладают природной резистентностью ко многим антибиотикам.

В последнее время хроническая инфекция, вызванная Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter ruhlandii, у больных МВ встречается часто. Согласно полученным данным, третьим по частоте встречаемости из НФМО является Achromobacter xylosoxidans. Он и Achromobacter ruhlandii при исследовании образцов от больных детей за 2012-2013 гг. выделялись в 9% случаев [14].

Род Acinetobacter

Номенклатура видов Acinetobacter находится в процессе развития. В настоящее время получили наименование 7 видов. Для рутинных клинических целей в номенклатуре достигнут компромисс, и организмы обозначаются как комплекс Acinetobacter calcoaceticus-baumannii. Большинство клинических лабораторий могут дифференцировать биовар anitratus от биовара lwofii на основе окисления глюкозы (anitratis) или неокисления последней (lwofii).

Подобно P. aeruginosa, бактерии рода Acinetobacter распространены в окружающей среде. У 25% здорового населения этим микроорганизмом колонизированы кожные покровы, а у 7% колонизирована глотка.

Виды Acinetobacter чаще всего вызывают внутрибольничную пневмонию. В больничном учреждении факторами риска для возникновения внутрибольничной пневмонии являются интубация, лечение антибиотиками, пребывание в палатах интенсивной терапии. Описан ряд инфекций, связанных с использованием медицинских приборов, например нозокомиальные менингиты. Чаще всего пневмонии как внутрибольничные инфекции возникали у больных раком и с травмами, а у ожоговых больных возникала раневая инфекция [10].

Stenotrophomonas maltophilia

Этот микроорганизм, ранее обозначавшийся как Pseudomonas maltophilia (до 1988 г.), позднее – Xanthomonas maltophilia (1995-1997 гг.), является распространенным комменсалом, легко выделяемым из воды, почвы и сточных вод. Значимость этого микроорганизма при выделении не всегда ясна и может зависеть от наличия факторов риска. Так, в одном исследовании, проведенном в общем госпитале в 1979 г., показано, что только 6 (4,6%) из 128 изолятов оказались клинически значимыми, то есть вызывали внутрибольничную инфекцию (ВБИ). С другой стороны, исследования в онкологическом центре показали, что ВБИ вызывали 114 (48%) из 237 изолятов. S. maltophilia наиболее часто связана с пневмонией, особенно у больных с МВ, но может также вызывать широкий круг других ВБИ. Наибольшее число инфекций встречается в больничных учреждениях, где факторы риска включают злокачественные опухоли, использование центральных венозных катетеров и лечение антибиотиками. В исследовании 91 случая бактериемий, вызванных S. maltophilia, у 78% больных были злокачественные опухоли, а источником инфекции был центральный венозный катетер. Показатель смертности от ВБИ в данном исследовании составил 38%.

Недавно описано несколько необычных проявлений инфекции, вызванной S. maltophilia. Так, в сообщении о 114 инфекциях из онкологического центра говорится, что у 17 больных наблюдали инфекции слизистой оболочки и кожных покровов и/или инфекции мягкой ткани, 6 имели метастатические целлюлиты, представлявшие собой кожные узлы с окружающими целлюлитами, и один – повреждение в виде гангренозной эктимы.

Каждый из рассматриваемых НФМО способен вызывать развитие хронической пневмонии у больных с МВ, исход которой, как правило, неблагоприятен для больного [10].

Микобактерии, не принадлежащие к виду Mycobacterium tuberculosis

В последние годы возросло количество случаев инфицирования больных МВ микобактериями, не относящимися к виду M. tuberculosis (Nontuberculous mycobacteria (NTM)). Из мокроты пациентов выделяли Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum [19]. Среди пациентов с муковисцидозом в США бактерии NTM идентифицировали в 12,5% случаев, причем наиболее часто выделяли Mycobacterium avium complex (MAC). На втором месте по частоте высева были Mycobacterium abscessus [20]. Особенностью культивирования микобактерий является длительный период роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, у больных МВ образцы мокроты контаминированы P. aeruginosa и другими микроорганизмами. Рекомендуется обрабатывать образцы мокроты от больных МВ для устранения контаминации перед посевом 0,25% N-ацетил-L-цистеином и 1% гидроксидом натрия (NALC-NaOH), а затем добавлять 5% oxalic acid (OXA). Особое значение для идентификации и типирования этих микроорганизмов имеют молекулярно-генетические методы (ПЦР, мультилокусное секвенирование, секвенирование генома). Для точной постановки диагноза необходимы выделение культуры микобактерий и дальнейшее генетическое типирование [21].

Анаэробные микроорганизмы

Использование анаэробных культуральных методик указывает на обнаружение в дыхательных путях больных МВ большого числа анаэробов [14, 22]. В исследовании Tunney и cоавт. анаэробные бактерии, прежде всего Prevotella, Veillonella, Propionibacterium и Actinomyces, были изолированы в 64% образцов мокроты у пациентов с МВ. Колонизация P. aeruginosa достоверно повышает вероятность присутствия анаэробов в мокроте. Сходные анаэробные штаммы были обнаружены в бронхоальвеолярной жидкости у детей с МВ. В двух исследованиях показано, что микроорганизмы из рода Prevotella особенно часто встречаются у больных МВ [22]. Более того, высказывается предположение об их провоспалительном действии, что подтверждается резким увеличением концентрации данных микроорганизмов в период обострения. Тем не менее точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным.

4.2. Алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции

Идентификация возбудителей хронической респираторной инфекции является важнейшим звеном в прогнозе для жизни больного МВ. В связи с этим в настоящее время в лабораторной диагностике используются современные микробиологические, молекулярно-генетические и молекулярно-биологические методы.

Правильная микробиологическая диагностика мокроты больных МВ затруднительна, так как микробная флора дыхательных путей у таких больных представлена часто ассоциациями, а некоторые микроорганизмы проявляют атипичные для своего вида фенотипические свойства, например ауксотрофные P. aeruginosa и SCV (small colony variants – фенотип мелких колоний) S. aureus. Разработанный алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции включает несколько этапов, позволяющих рационально и максимально достоверно провести диагностику смешанной хронической инфекции легких.

Материалом при исследовании НДП у больных МВ являются мокрота при кашле, мазок из зева после кашля, ларингеальный или назофарингеальный аспират, индуцированная гипертоническим раствором мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, материал щеточной биопсии при бронхоскопии. По данным Equi et al., чувствительность и специфичность результатов посевов мазка из зева после кашля по сравнению с результатами посевов спонтанной мокроты составляют 34 и 100% соответственно. Чувствительность показывает процент положительного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с положительным результатом, полученным при посеве мокроты. Специфичность показывает процент отрицательного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с отрицательным результатом, полученным при посеве мокроты [14]. Установлено, что любая задержка, в частности хранение при комнатной температуре (20-25 °C), приводит к увеличению количества быстро растущих бактерий, что может привести к угнетению роста истинных патогенов, и, наоборот, хранение в холодильнике (4 °C) может привести к гибели термофильных патогенных микроорганизмов.

Перед посевом мокроту предварительно отмывают в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и гомогенизируют механическим (перемешивание в течение 10 мин стерильными микробиологическими бусами) или химическим (обработка дитиотреитолом) методом.

Обязательным для установления диагноза хронической инфекции, вызванной ассоциацией возбудителей, является неоднократное в течение 6 месяцев выделение чистой культуры микроорганизмов – так называемый «золотой стандарт». Поэтому посев мокроты осуществляют на универсальные среды – 5% кровяной и шоколадный агары с накладыванием на поверхность дисков с гентамицином и оптохином для выявления Haemophilus influenzaе и Streptococcus pneumoniaе и селективные среды для выделения S. aureus, P. aeruginosa, Bcc, Candida spp., Enterobacteriacеае и НФМО (ЖСА, цетримидный агар, BCSA, Сабуро, Эндо).

Идентификацию основных возбудителей хронической инфекции проводят следующим образом:

Идентификация золотистого стафилококка

Идентификацию стафилококков проводят на селективной среде – желточно-солевом агаре (ЖСА). На основании фенотипических свойств – наличия пигмента и лецитиназной активности штаммы стафилококков относят к виду S. аureus. Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus также необходимо использовать тест на коагулазу. Летициназоположительные стафилококки, характеризующиеся положительным тестом на коагулазу, относят к виду S. аureus.

У больных МВ встречаются атипичные формы золотистого стафилококка, которые трудно выделять и идентифицировать общепринятыми методами ввиду их замедленного роста и нетипичных для стафилококков свойств. Такие атипичные формы называют штаммами с фенотипом мелких колоний (small-colony variant (SCV)). Бактерии медленно растут, в результате через 48 ч роста формируются очень маленькие, без пигмента и гемолиза колонии, имеющие fried-egg-фенотип («яичницы-глазуньи») или точечный фенотип, редко – мукоидный фенотип. SCV-стафилококки имеют также другие атипичные, не свойственные метаболически нормальным стафилококкам свойства. Могут быть лецитиназоотрицательными, слабо коагулазоположительными, характеризоваться отсутствием фермента маннитола, ауксотрофными по гемину, тимидину и менадиону и характеризоваться возможностью возврата в родительскую форму. Часто ассоциируются с персистентной инфекцией и обладают резистентностью к антибиотикам [10].

По данным Gómez-González et al., распространенность SCV S. aureus в клинических экземплярах составляет приблизительно 1%, а среди больных МВ – до 17%. SCV S. aureus может часто высеваться от пациентов, которые получали гентамицин или другие аминогликозиды [11].

Лабораторная диагностика, определение чувствительности к антибиотикам атипичных форм золотистого стафилококка могут иметь существенное значение для выбора тактики антимикробной терапии стафилококковой инфекции у больных МВ.

В результате проведенных исследований было выявлено 12 штаммов SCV [14]. При этом в 6 случаях наблюдали смешанную инфекцию с P. aeruginosa. Четыре из выделенных штаммов были резистентными более чем к трем группам антибиотиков, у двух из которых выявлен ген MecA. Поэтому при выделении штаммов с SCV-фенотипом необходимо подтвердить принадлежность к виду S. aureus с использованием молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST) и исследовать их на антибиотикочувствительность.

При исследовании антибиотикочувствительности 208 штаммов стафилококков диско-диффузионным методом или с помощью ATB-стрипов (BioMerieux) было показано [14], что 31 (15%) штамм устойчив к оксациллину. 15 из этих штаммов были коагулазоположительными, что позволило, учитывая также пигментообразование и лецитиназную активность, отнести их к MRSA, а остальные 16 штаммов – к метициллин-резистентным коагулазоотрицательным стафилококкам (КОС).

Для определения устойчивости стафилококков к метициллину обычно используют диско-диффузионный метод [23]. Применяют диски с оксациллином (1 мкг), так как оксациллин является наиболее стабильным антибиотиком при хранении. Идентификацию осуществляют в условиях, способствующих экспрессии устойчивости, а именно на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 4% NaCl, инкубируя чашки Петри в течение 24 ч при 37 °С. Некоторые исследователи предлагают проводить инкубацию в течение 48 ч при 30 °С [23].

В связи с имеющейся гетерогенностью устойчивости к метициллину ряд исследователей рекомендуют проведение идентификации гена mecA молекулярно-генетическими методами с использованием ДНК-зондов или амплификацией гена в ПЦР.

При выявлении у стафилококков устойчивости к метициллину диско-диффузионным методом и идентификации гена mecA генетическими методами такие штаммы рекомендуется далее тестировать на устойчивость к ванкомицину, так как большинство VISA и гетеро-VRSA обычно устойчивы к метициллину.

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) установил, что стафилококки, у которых рост ингибируется 4 и менее mg/ml ванкомицина, являются чувствительными, 8-16 mg/ml – умеренно устойчивыми и 32 и более mg/ml – резистентными. В соответствии с этими показателями в литературе умеренно устойчивые к ванкомицину штаммы S. aureus (MIC ванкомицина = 8 mg/ml) обозначают VISA, а резистентные (MIC = 32 и более mg/ml) – VRSA.

Большинство VISA-изолятов первоначально выглядят в виде смешанной популяции, состоящей из различных по морфологии и пигменту колоний. Преобладают большие, кремового цвета колонии и маленькие колонии серого цвета. Однако при тестировании различных по морфологии и цвету колоний на устойчивость к ванкомицину они демонстрируют идентичные профили антибиотикограмм и ДНК при тестировании с помощью пульс-электрофореза.

Так как способность формирования биопленок является свойством штаммов, способных вызывать хроническую инфекцию, оптимальным для полной характеристики штаммов является определение способности к формированию биопленок штаммами золотистого стафилококка. Было изучено формирование биопленок у 106 штаммов стафилококков, выделенных от больных МВ [14]. Из 106-ти изученных штаммов у 16 (16,9%) наблюдали выраженную способность к формированию биопленки, у 54 (57,2%) – умеренную, у 36 штаммов (38%) – низкую.

Таким образом, для точной идентификации видов стафилококков необходимо использовать комплекс бактериологических, биохимических, молекулярно-генетических методов.

Идентификация неферментирующих грамотрицательных микроорганизмов (НФМО)

Идентификация Pseudomonas aeruginosa

Род Pseudomonas (sensu stricto) включает 11 видов. Для больных МВ наиболее значимым является Pseudomonas aeruginosa.

Типичные изоляты синегнойной палочки идентифицируют по таким свойствам, как пигментообразование, положительный тест на оксидазу, рост при 42 °С, характерный земляничный запах, рост на цетримидном агаре. При этом от больных МВ с хронической синегнойной инфекцией часто изолируют атипичные формы P. aeruginosa, которые трудно идентифицировать без применения молекулярно-генетических методов (ПЦР) [24].

Псевдомонады хорошо растут на стандартных лабораторных средах, таких как триптиказный соевый агар с 5% бараньей кровью или шоколадный агар. Подобная среда может быть использована для выделения микроорганизмов из клинических проб, например цереброспинальной жидкости, тканевой жидкости или жидкости после перитонеального диализа, когда наиболее вероятным является выделение смешанной флоры. Для выделения P. aeruginosa из образцов, содержащих смешанную флору, используются селективные среды. Агар МакКонки – наиболее часто используемая селективная среда для выделения большинства псевдомонад, включая мукоидные штаммы P. aeruginosa от больных МВ. Селективные среды, содержащие селективные агенты, такие как цетримид, ацетамид, нитрофурантоин и 9-хлор-9-[4-(диэтиламино)-фенил]-9,10-дигидро-10-фенилакридин гидрохлорид (С390), также могут быть использованы для изоляции P. aeruginosa из клинических образцов и образцов окружающей среды [14, 22].

Большинство изолятов P. aeruginosa легко распознаются на первичной питательной среде на основе морфологических характеристик колоний, продукции диффундирующего пигмента, а также характерного запаха культуры «земляничного мыла», или, как его характеризуют зарубежные микробиологи, запаха «винограда или зерна тако». Колонии обычно имеют плоскую поверхность и склонность к ползучему росту, неровные края и металлический блеск, который часто связан с аутолизом. Существуют и другие виды колоний, включающие гладкие, колиформные колонии, а также слизистые, карликовые и мукоидные формы. Мукоидный вариант колоний преобладает в образцах из респираторного тракта больных МВ. P. aeruginosa продуцирует целый ряд водорастворимых пигментов. Когда пиовердин сочетается с голубым водорастворимым пигментом феназином, пиоцианин приобретает светло-зеленый цвет. Этот микроорганизм также может продуцировать один из двух водорастворимых пигментов: пиорубрин (красный) или пиомеланин (коричневый или черно-коричневый). Идентификация P. aeruginosa может быть подтверждена на основании положительного теста на оксидазу. Могут также встречаться беспигментные штаммы P. aeruginosa, очень часто это штаммы с повышенным содержанием мукоида, выделенные из секрета респираторного тракта больных МВ. На практике обнаружение мукоидных штаммов, представляющих собой грамотрицительные неферментирующие глюкозу палочки, выделенные из образцов респираторного тракта больных МВ, является достаточным для идентификации такого микроорганизма, как P. aeruginosa. Однако если выделяется беспигментный штамм, необходимо проследить основные биохимические характеристики, включая рост при 42 °С, гидролиз ацетамида, редукцию нитратов с образованием нитрогенного газа.

Значимым признаком для P. aeruginosa, как и для остальных представителей неферментирующих бактерий, является природная устойчивость ко многим антибиотикам, что, вероятно, обусловлено, с одной стороны, тем, что для многих микроорганизмов основной экологической нишей является почва (а среди почвенных микроорганизмов известно достаточное число штаммов-продуцентов антибиотиков), а с другой – многообразием у этих представителей различных внехромосомных элементов (плазмид, бактериофагов), способных нести в составе генома детерминанты лекарственной устойчивости.