Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов

Первый тип отмечался в основном у эритроцитов крови здоровых детей, второй у эритроцитов больных НС. Было показано, что процесс перехода от диска к сфере обратим: при переносе эритроцитов сферической формы в аутоплазму они восстанавливают свою форму до двояковогнутого диска, что подтверждается данными сканирующей электронной микроскопии (Denhcke, 1968, Weed Besis, 1973).

Для проведения сравнительной характеристики эритроцитов в норме и при НС по признаку сферуляции было выбрано два основных разведения плазмы (1:5 и 1:1О), при которых проводился анализ распределения эритроцитов в зависимости от их формы (таблица 2).

Таблица 2. Процентное распределение эритроцитов в зависимости от их формы при двух разведениях плазмы изотоническим раствором (1:5 и 1:1О) в норме и при наследственном сфероцитозе ( НС)

Сравнение полученных данных показало, что эритроциты больных НС переходят от формы двояковогнутого диска к сфере при меньших разведениях аутоплазмы изотоническим раствором NaCl по сравнению с нормой.

Переход эритроцитов в сферическую форму наблюдался также при механическом воздействии на клетку, так же при добавлении гетерогенной сыворотки. Эритроциты, выделенные из селезенки сразу после ее удаления по поводу НС, также имели сферическую форму.

Второй тип изменений формы эритроцитов имел место при разведении взвеси эритроцитов изотоническим раствором глюкозы. При этом наблюдалось общее искажение формы эритроцита, образование утолщения по краям, нарушение симметрии формы эритроцитов.

Третья группа изменений формы эритроцитов имела место при анализе клеток, предварительно подвергшихся аутогемолизу ( t =37 градусов по С) , 5-6 часов).Эритроциты при разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl исследовались в микроскопе с лазерным освещением. Клетки имели искаженную поверхность, на которой постепенно

выбухали микропузырьки. Они некоторое время сохраняли связь с эритроцитами в виде жгутиков, а затем полностью отделялись от клеток.

Полученные данные можно представить в виде схемы (Рис. 7), в которой показаны три пути изменения размеров и формы эритроцитов. Причем, если первый и третий пути являются в принципе обратимыми, то второй путь необратим, вследствие потери части поверхности клетки в виде микропузырьков.

Рис. 7. Основные типы изменений формы и размеров эритроцитов. (Пояснение в тексте.)

Исследованные типы изменений формы эритроцитов хорошо согласуются с классификацией, предложенной на основе анализа клеток по данным электронной микроскопии (Козинец Г.И., соавт., 1979) но по данным голографической интерферометрии и лазерной микроскопии размеры эритроцитов значительно отличаются от результатов, полученных методом растровой электронной микроскопии, так как при обработке эритроциты уменьшаются в размерах (Крымский Л.Д. ‚соавт., 1976).

Исследование новыми методами динамики перехода формы эритроцита от диска к сфере и явления отщепления микропузырьков от поверхности клеток представляет значительный интерес, так как по современным данным эти явления лежат в основе того многообразия форм и типов эритроцитов, наблюдаемых с помощью электронномикроскопических методов в норме и патологии. Показано, что сферуляция эритроцитов может происходить in vitro как при действии различных веществ ( La Selle e. а. ,1980), так и пря взаимодействии с макрофагами ( Guerry е.а. , 1967). Длительное хранение эритроцитов также в конечном итоге приводит к изменению формы эритроцитов до сферической (Крымский Л.Д., соавт., 1976). Сфероциты отмечаются при различного рода анемиях и других заболеваниях, приводящих к нарушению свойств эритроцитов (Идельсон Л.И., 1979). Таким образом, явление сферуляции, наблюдаемое как in vivo так in vitro является единым ответом клетки на разнородные воздействующие факторы. С другой стороны, показано, что нормальная селезенка, задерживает сфероциты независимо от того, врожденное это или искусственно созданное изменение эритроцитов (Канаев С.В., Тушинская М.М., 1979/. В связи с вышеизложенным представляет интерес тот факт, что эритроциты при НС хотя и не имеют форму сферы, однако переход от диска к сфере при данном заболевании происходит при более слабых воздействиях по сравнению с нормой.

Результаты работы показали, что такие сложные процессы как явление сферуляции эритроцитов и отщепление микропузырьков от поверхности могут быть прослежены в динамике методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии. Оценка этих сложных явлений новыми методами углубляет представления о процессах жизнедеятельности эритроцитов периферической крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количественная оценка состояния эритроцитов в норме и патологии, проведенная методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в проходящем и отраженном свете показана эффективность использования данных методов для анализа эритроцитов, позволило в количественном виде выразить общие закономерности изменения размеров и формы эритроцитов, массы гемоглобина и его концентрации в клетках вне зависимости от патологии. Применением новых методов с использованием микрокиносъемки и видеозаписи позволило на нефиксированных клетках проследить основные виды преобразования формы и размеров эритроцитов образования микропузырьков на поверхности эритроцитов и перехода от диска к сфере и дать им количественную оценку.

В результате проделанной работы была разработана схема голографического интерференционного микроскопа, выявлены достоинства метода (возможность количественной оценки нефиксированных клеток), и недостатки (трудоемкость обработки данных), указаны пути улучшения прибора: введение электронного устройства съема оптической информации и ввода ее в ЭВМ). Разработаны методики интерференционного анализа эритроцитов.

Методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в значительной степени дополняют традиционные микроскопические методы исследования: анализ клеток в проходящем свете, методы темного поля и фазового контраста, они обладают рядом преимуществ, расширяющих возможности оптической микроскопии. Анализ интерферограмм эритроцитов позволяет проводить количественную оценку формы клеток вводя соответствующие коэффициенты, вычислять площадь поверхности и объем эритроцитов. Одновременно можно измерять массу гемоглобина и его концентрацию. Голографический микроскоп позволяет наблюдать клетки в проходящем лазерном свете и выявлять наличие неоднородностей в клетках. Микрокиносъемка интерферограмм эритроцитов в отраженном лазерном свете позволяет следить за преобразованиями формы и поверхности клеток. Качественная и количественная оценка объектов исследования может проводится без их окраски и фиксации, что позволяет проводить анализ клеток в динамике.

ВЫВОДЫ

1. На основе отечественной аппаратуры создан оригинальный макет голографического микроскопа, который дает возможность методами интерферометрии и лазерной микроскопии проводить количественную и качественную оценку состояния эритроцитов в динамике.