Czytaj książkę: «Начальные методы клеточной биологии»

© Антипова Н.В., Черткова Р.В., Князев Е.Н., Скворцов Д.А., 2026

Предисловие

Клеточная биология – раздел биологии, в котором изучают строение и жизнедеятельность клеток живых организмов, процессы клеточного размножения, старения и смерти. Настоящая методическая разработка предназначена для преподавателей и учебных ассистентов дисциплины «Клеточная биология: основы биопроцессов», для студентов направления подготовки «06.03.01 Биология», обучающихся по образовательной программе «Клеточная и молекулярная биотехнология» НИУ ВШЭ, а также для всех интересующихся биологией.

Пособие позволяет студентам получить начальные знания и навыки работы с культурами клеток, изучить методы хранения и культивирования клеточных культур. Также учащиеся ознакомятся с использованием клеток в научных исследованиях. Студенты приобретают навыки работы в стерильном помещении; в ходе лабораторных работ узнают о реактивах и посуде, необходимых для культивирования клеток, составляют полную питательную среду и выращивают на ней клетки. При выполнении практикума знакомятся с методами исследования функционального состояния клетки: окрашивают клетки прижизненными красителями и изучают фиксированные образцы, проводят тесты на цитотоксичность веществ и подвижность клеток.

По завершении лекционного и практического разделов курса студент:

• культивирует бактерии, работает в стерильных условиях;

• проводит определение титра бактерий и оценку их чувствительности к антибиотикам;

• культивирует дрожжи, объясняет разницу чувствительности дрожжей и бактерий к антибиотикам;

• культивирует клеточные линии млекопитающих, наблюдает за ними и проводит прижизненное окрашивание;

• проводит функциональные тесты с клетками млекопитающих (скретч-тест и анализ цитотоксичности);

• объясняет и иллюстрирует организацию хромосом в клетке; может объяснить, как устроено клеточное ядро и основные субъядерные структуры;

• распознает органеллы клетки, описывает их функции и протекающие в них процессы, а также структуру и функции клеточных органелл;

• наблюдает в микроскоп деление эукариотической клетки, распознает основные признаки фаз клеточного деления.

Введение

Основные понятия работы с культурами эукариотических клеток многоклеточных организмов

Эукариотические клетки человек культивирует уже несколько тысячелетий, пример тому – дрожжи, которые по сей день используют для выпечки хлеба и в пивоварении. В ХХ в. ученые начали разработку методов культивации клеток многоклеточных организмов, включая клетки млекопитающих. Благодаря созданию искусственных питательных сред и выращиванию клеток вне организма появилась возможность исследовать клеточную и молекулярную биологию человека. На сегодняшний день существуют тысячи клеточных линий различного происхождения и различные методы их культивирования, что позволяет изучать как внутриклеточные процессы, так и межклеточные взаимодействия.

Клеточные культуры эукариотических организмов получают непосредственно из тканей. Разрушение ткани можно производить как механически, так и с использованием ферментов, или комбинируя оба метода. Для ферментативной обработки чаще всего используют трипсин в комбинации с другими ферментами, в частности, коллагеназой или эластазой. При этом происходит разрушение внеклеточного матрикса, поддерживающего сложную организацию ткани, и высвобождаются отдельные клетки.

Клетки, изолированные из ткани, которые начинают делиться в искусственных условиях, называют первичной клеточной культурой. Она может содержать все типы клеток исходной ткани. В зависимости от условий культивирования первичная культура либо остается разнородной, тогда в ее составе будет присутствовать большинство типов клеток исходной ткани, либо становится однородной. Такая однородность, как правило, возникает при перерождении клеток, и ее можно объяснить увеличением скорости деления одного типа клеток по сравнению с другими. Возможно также отмирание большей части клеток исходной ткани при сохранении пролиферации у определенной популяции клеток.

По способу культивации выделяют суспензионные культуры (клетки растут в виде взвеси в питательной среде) и адгезионные (клетки растут прикрепленными к специально обработанной поверхности). Возможно выращивать клетки и в трехмерных структурах. Так, когда клетки выращивают в условиях адгезии друг к другу, при делении они собираются в сфероиды, причем клетки на поверхности и в объеме могут различаться по свойствам. В гистотипической культуре трехмерная структура формируется из одного типа клеток. Культура, формирующая структуру из разных клеточных популяций, называется органотипической.

Когда адгезионные клетки, выделенные из ткани, при делении займут всю доступную поверхность сосуда, их необходимо перенести в емкость со свободной поверхностью, где они продолжат деление. С этого момента клетки становятся культивируемой клеточной линией. Перенос культуры в новые культуральные флаконы и смена ростовой среды на новую называется субкультивированием или пересевом. При пересеве часть клеток погибает, а клетки, делящиеся быстрее, накапливаются. В результате субкультивирования можно получить и в дальнейшем охарактеризовать новую клеточную линию.

Наращивание биомассы предполагает субкультивирование клеточной линии, т. е. регулярный пересев в новый флакон при достижении определенной концентрации клеток и/или истощении среды. Каждый перенос клеток из одного флакона в новый называется пассаж.

Клеточная линия – это совокупность клеток, полученная из первичной культуры путем увеличения количества клеток после нескольких генераций с преобладанием клеток или линий дифференцировки с высоким темпом роста и высокой однородностью клеточной популяции [Фрешни, 2010].

Клеточные линии получают из различных тканей. Исходными могут быть дифференцированные клетки, которые при культивировании можно стабильно поддерживать в культуре. Возможно также запустить процесс дедифференцировки так называемых первичных клеток для их культивирования. Важным исходным биоматериалом являются опухоли, уже содержащие дедифференцированные клетки, и недифференцированные постнатальные либо эмбриональные стволовые клетки.

Число возможных делений нормальных соматических клеток ограничено (такое явление называют лимитом, или пределом, Хейфлика). После определенного числа делений (обычно 30–52 для клеток человека) их рост останавливается, клетки переходят в состояние старения и затем погибают. Однако некоторые клетки способны делиться бесконечно – например, выделенные из опухолевых тканей или подвергшиеся направленной либо спонтанной трансформации. Культуры, состоящие из таких клеток, называют иммортализованными (постоянными, непрерывными) клеточными линиями.

У клеток эукариотических линий может быть разный хромосомный набор. Если клетки имеют измененное число хромосом, кратное гаплоидному набору (23 для человеческих клеток), такое явление носит название полиплоидия. Рассматривая митотические хромосомы фиксированных клеток под микроскопом, можно наблюдать диплоидный, триплоидный, тетраплоидный набор. Если же клетки содержат измененное число хромосом, некратное гаплоидному набору, это называется анеуплоидия. При анеуплоидии число копий отдельных хромосом может различаться, например, при появлении дополнительной хромосомы возникает так называемая трисомия, а при исчезновении одной хромосомы – моносомия. В клеточных линиях встречается сочетание полиплоидии и анеуплоидии по нескольким хромосомам, при этом в отдельных клетках одной и той же линии наборы хромосом могут отличаться.

Культуры клеток используют для фундаментальных исследований и в некоторых биотехнологических процессах. В процессе культивирования можно наблюдать за отдельными функциями клеток изучаемого организма, что приводит к пониманию биологических процессов и сокращает работу с животными моделями. В лабораториях на клеточных линиях проверяют нейтрализующую активность антител, влияние внеклеточных микровезикул на молекулярные механизмы внутри клетки. Межклеточные взаимодействия, влияние гормонов, лиганд-рецепторное взаимодействие также исследуются с применением клеточных технологий. На клетках изучают цитотоксичность новых соединений и проводят первичные тесты потенциальных лекарственных средств. Производство рекомбинантных белков, в том числе антител, и создание вакцин – биотехнологические области применения клеточных культур.

Преимуществом исследований на культурах клеток является возможность культивировать многие линии в стандартных условиях, что существенно упрощает проведение работ и уменьшает их стоимость. При выращивании клеточных культур удается строго контролировать концентрации питательных и биологически активных веществ. К недостаткам результатов, полученных на культивируемых клетках, можно отнести тот факт, что клеточные линии отличаются по степени дифференцировки от первичных культур клеток и тем более от условий in vivo (т. е. в живом организме) и могут изменяться в ходе длительного культивирования.

Сертификация охарактеризованных клеточных линий и аккредитация лабораторий нужны для повторяемости и воспроизводимости результатов. Для хранения охарактеризованных клеточных линий созданы специальные клеточные коллекции.

Российская коллекция клеточных культур включает следующие специализированные коллекции:

• Коллекция культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН);

• Коллекция клеточных линий человека и животных для исследований в области вирусологии (НИИ гриппа МЗ РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных медицинского назначения (Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций Роспотребнадзора МЗСР РФ);

• Коллекция перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, РАСХН);

• Всероссийская коллекция постоянных линий клеток беспозвоночных (Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, РАСХН);

• Всероссийская коллекция культур клеток высших растений (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН);

• Коллекция генетически трансформированных pRi корней высших растений (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН).

В рамках поддержания Российской коллекции клеточных культур осуществляются паспортизация, хранение и получение новых линий. Некоторые научно-исследовательские институты и фирмы имеют индивидуальные коллекции клеточных культур; многие фирмы поставляют клеточные линии и из зарубежных коллекций.

Наиболее крупные клеточные коллекции за рубежом – это American Type Culture Collection (ATCC) в США, European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) в Европе, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen в Германии, Riken BRC Cell Engineering Division – Cell Bank в Японии.

Все клеточные линии в данных коллекциях идентифицируются, как правило, по характерному набору коротких тандемных повторов. Рекомендуемые идентификация и описание клеточных линий осуществляются в соответствии с принятыми стандартами GLP (Good Laboratory Practice – «надлежащая лабораторная практика»), требованиями ВОЗ, Минздрава Российской Федерации, FDA (Food and Drug Administration) США и других локальных органов – благодаря этому данные линии могут воспроизводимо использоваться в научных и клинических целях.

Основные принципы культивирования клеток

Культивирование клеток представляет собой фундаментальный метод современной биологии и медицины, позволяющий исследователям изучать клеточные процессы, проводить эксперименты и разрабатывать новые терапевтические подходы.

Основные компоненты культивирования клеток

1. Клеточные субстраты – поверхности, на которых клетки крепятся и растут. Это могут быть поверхности чашек Петри или иной культуральной посуды из стекла или пластика, а также специальные материалы с определенными свойствами адгезии для конкретных типов клеток. Материалы обрабатывают физически и/или химически для улучшения прикрепления клеток (например, частично окисляют плазмой или химическими окислителями), а также покрывают определенными веществами, улучшающими прикрепление и рост клеток (например, полилизином или коллагеном).

2. Питательные среды – специально разработанные смеси питательных веществ, которые обеспечивают клеткам все необходимые компоненты для роста и размножения. Питательные среды могут быть жидкими или гелеобразными и содержать различные добавки, такие как гормоны, антибиотики и факторы роста.

3. Условия инкубации – оптимальные условия для роста клеток, т. е. температура, влажность, содержание CO₂ и другие параметры окружающей среды. Обеспечение правильных условий играет важную роль в успешном культивировании клеток.

Подготовка питательной среды

Подготовка оптимальной питательной среды является одним из ключевых этапов успешного культивирования клеток, поскольку состав среды влияет на клеточный метаболизм и, соответственно, релевантность результатов эксперимента тому, что происходит in vivo. Культуральная среда представляет собой смесь питательных веществ, которые обеспечивают клеткам все необходимые компоненты для роста, размножения и поддержания их жизнеспособности.

Питательная среда для культивирования клеток обычно включает буферные системы, аминокислоты, витамины, углеводы и дополнительные компоненты, такие как гормоны и факторы роста. Выбор компонентов зависит от типа клеток, которые планируется культивировать, и условий, необходимых для их оптимального роста. Так, некоторые клеточные линии требуют дополнительного обогащения среды определенными аминокислотами или факторами роста для нормального функционирования. Часто в качестве источника гормонов и факторов роста используют эмбриональную телячью сыворотку (fetal bovine serum, или fetal calf serum).

Питательная среда может быть как изготовленной коммерчески, так и приготовленной самостоятельно в лаборатории. Для самостоятельной подготовки среды необходимо смешать все компоненты в указанных пропорциях в дистиллированной воде, при необходимости регулируя pH раствора. После приготовления среду следует стерилизовать, чтобы предотвратить загрязнение микроорганизмами.

Стерильность является критическим условием для успешного культивирования клеток. Даже небольшое загрязнение среды микроорганизмами может привести к контаминации культуры и нежелательным изменениям в клеточном росте. В связи с этим необходимо обеспечивать стерильность всех используемых материалов, а также среды, инструментов, культуральной посуды и строго следить за соблюдением правил асептики при проведении клеточных экспериментов.