Podstawy biologii komórki t. 2

Tekst
0
Recenzje
Przeczytaj fragment
Oznacz jako przeczytane
Jak czytać książkę po zakupie
Czcionka:Mniejsze АаWiększe Aa

Białka błonowe można przeprowadzić w formę rozpuszczalną w detergentach

Aby w pełni zrozumieć białko, należy dokładnie poznać jego strukturę, co w przypadku białek błonowych stwarza szczególne problemy. Większość procedur biochemicznych ustalono dla cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie. Białka błonowe są jednak skonstruowane tak, aby działały w środowisku, które jest częściowo wodne i częściowo tłuszczowe, a wyprowadzenie ich z tego środowiska w celu badania w izolacji od niego i przy zachowaniu ich podstawowej struktury nie jest łatwym zadaniem.

Zanim pojedyncze białko zostanie szczegółowo zbadane, musi zostać oddzielone od wszystkich innych białek komórkowych. W przypadku większości białek błonowych pierwszym etapem tego procesu oczyszczania jest solubilizacja (rozpuszczenie) błony czynnikami, które niszczą dwuwarstwę lipidową przez rozerwanie oddziaływań hydrofobowych. Najczęściej stosowanymi w tym celu czynnikami są detergenty (film 11.5) – małe, amfipatyczne, podobne do lipidów cząsteczki różniące się od fosfolipidów błonowych tym, że mają tylko jeden hydrofobowy ogon (rys. 11.26). Z powodu pojedynczego ogona hydrofobowego cząsteczki detergentu są w kształcie stożka; w wodzie te stożkowe cząsteczki mają tendencję do agregowania w małe skupiska zwane micelami, nie tworzą natomiast dwuwarstw jak fosfolipidy, które – dzięki dwóm ogonom hydrofobowym – mają bardziej cylindryczny kształt.


Rys. 11.26. SDS i Triton X-100 to dwa powszechnie stosowane detergenty. Dodecylosiarczan sodu (SDS) jest silnym detergentem jonowym – to znaczy ma zjonizowaną (obdarzoną ładunkiem) grupę na swoim hydrofilowym końcu (kolor niebieski). Triton X-100 jest łagodnym niejonowym detergentem – to znaczy zawiera niezjonizowane, ale polarne ugrupowanie na swoim hydrofilowym końcu (kolor niebieski). Część hydrofobową obu detergentów zaznaczono kolorem czerwonym. Ujęta w klamrę część cząsteczki Triton X-100 jest powtórzona około osiem razy. Silne detergenty jonowe, takie jak SDS, nie tylko oddzielają cząsteczki lipidów od białek, lecz także rozfałdowują białka (patrz panel 4.5)

PYTANIE 11.5

Wyjaśnij, dlaczego w przypadku dwóch detergentów przedstawionych na rys. 11.26 części cząsteczek zaznaczone kolorem niebieskim są hydrofilowe, a kolorem czerwonym – hydrofobowe. Narysuj krótki odcinek łańcucha polipeptydowego złożonego z trzech aminokwasów z hydrofobowymi łańcuchami bocznymi (patrz panel 2.6) i zastosuj podobny schemat kolorów. Wskaż, które części polipeptydu utworzyłyby wiązania wodorowe z wodą.


Rys. 11.27. Białka błonowe mogą przechodzić w formę rozpuszczalną (ulec solubilizacji) przy użyciu łagodnego detergentu, takiego jak Triton X-100. Cząsteczki detergentu (kolor złoty) pokazano zarówno jako monomery, jak i micele, powstające w wyniku agregacji tych cząsteczek w wodzie. Detergent rozrywa dwuwarstwę lipidową i oddziałuje z przechodzącą przez błonę hydrofobową częścią białka (kolor ciemnozielony). To powoduje wprowadzenie białek do roztworu w postaci kompleksów białko– –detergent. Jak pokazano, fosfolipidy w błonie również ulegają solubilizacji przez detergenty, tworząc micele lipid-detergent

Gdy zmieszamy duży nadmiar detergentu z błonami, hydrofobowe końce cząsteczek detergentu oddziałują z przechodzącymi przez błonę obszarami hydrofobowymi białek transbłonowych, jak również z hydrofobowymi ogonami cząsteczek fosfolipidów, i tym samym zakłócają strukturę dwuwarstwy lipidowej i oddzielają białka od większości fosfolipidów. Ponieważ drugi koniec cząsteczki detergentu jest hydrofilowy, oddziaływania te przeprowadzają białka błonowe do roztworu wodnego jako kompleksy białko–detergent; w tym samym czasie detergent powoduje także solubilizację fosfolipidów (rys. 11.27). Kompleksy białko–detergent można następnie oddzielić od siebie i od kompleksów lipid–detergent w celu wykonania dalszych badań.

Znamy kompletną strukturę względnie niewielu białek błonowych

Znaczną część wiedzy o strukturze białek błonowych zdobyto pośrednio. Standardową metodą bezpośredniego określania przestrzennej struktury białka jest krystalografia rentgenowska. Wymaga ona jednak uporządkowanego układu krystalicznego cząsteczki. Ponieważ białka błonowe muszą być oczyszczane w micelach tworzonych przez detergent, które często mają niejednorodną wielkość, ich krystalizacja jest trudniejsza niż białek rozpuszczalnych, znajdujących się w cytozolu komórki lub środowisku zewnątrzkomórkowym. Niemniej jednak, dzięki najnowszym postępom w technice krystalografii rentgenowskiej, polegającym na stosowaniu nowych potężnych narzędzi, takich jak mikroskopia krioelektronowa, poznano struktury o wysokiej rozdzielczości licznych białek błonowych (patrz panel 4.6).

Jednym z przykładów takich białek jest bakteriorodopsyna. Jej struktura po raz pierwszy ujawniła, jak dokładnie helisy α przechodzą przez dwuwarstwę lipidową. Bakteriorodopsyna jest małym białkiem występującym w dużych ilościach w błonie komórkowej Halobacterium halobium, archeona żyjącego w słonych bagnach. Bakteriorodopsyna jest transbłonowym białkiem transportującym, które pompuje H+ (protony) z wnętrza komórki na zewnątrz. Każda cząsteczka bakteriorodopsyny zawiera pojedynczy chromofor, absorbującą światło, niebiałkową cząsteczkę nazwaną retinalem, która nadaje białku i całemu organizmowi kolor głębokiego fioletu. Gdy retinal, który jest kowalencyjnie przyłączony do jednej z transbłonowych helis α bakteriorodopsyny, pochłania foton światła, zmienia kształt. Ta zmiana kształtu powoduje, że otaczające helisy przechodzą szereg małych zmian konformacyjnych, których skutkiem jest wypompowanie jednego protonu z retinalu na zewnątrz komórki (rys. 11.28).


Rys. 11.28. Bakteriorodopsyna działa jako pompa protonowa. Łańcuch polipeptydowy tego małego białka (o długości około 250 aminokwasów) przechodzi przez dwuwarstwę lipidową w postaci siedmiu helis α. Zaznaczono umiejscowienie retinalu (kolor fioletowy) i prawdopodobną ścieżkę transportu protonów podczas cyklu pompowania aktywowanego światłem (czerwone strzałki). Strategicznie rozmieszczone polarne łańcuchy boczne aminokwasów – zaznaczone kolorem czerwonym, żółtym i niebieskim – kierują ruchem protonu (H+) w poprzek dwuwarstwy, pozwalając mu uniknąć kontaktu ze środowiskiem lipidowym. Retinal jest następnie regenerowany przez pobranie H+ z cytozolu, co przywraca białko do wyjściowej konformacji – cykl został pokazany w filmie 11.6. Retinal służy także do wykrywania światła w ludzkim oku, gdzie jest przyłączony do białka o strukturze bardzo podobnej do bakteriorodopsyny (zaadaptowano z H. Luecke i in., Science 286: 5438: 255–260, 1999)

PYTANIE 11.6

Przyjrzyj się uważnie białkom transbłonowym pokazanym na rysunku 11.29B. Co możesz powiedzieć o ich ruchliwości w błonie?

W obecności światła słonecznego tysiące cząsteczek bakteriorodopsyny pompuje H+ z komórki, wytwarzając gradient stężeń H+ w poprzek błony komórkowej. Komórka wykorzystuje ten gradient protonów do przechowywania energii i przekształcania jej w ATP, jak omówimy to szczegółowo w rozdziale 14. Bakteriorodopsyna jest pompą, klasą białka transbłonowego, która aktywnie przenosi małe cząsteczki organiczne i nieorganiczne jony do i z komórek. Działanie innych ważnych pomp transbłonowych omówimy w rozdziale 12.

Błona komórkowa jest wzmocniona przez znajdującą się pod nią korę komórki

Błona komórkowa sama w sobie jest niezwykle cienka i delikatna. Trzeba by nałożyć na siebie 10 000 błon komórkowych, aby osiągnąć grubość kartki papieru. Dlatego też większość błon komórkowych jest wzmacniana i podparta rusztowaniem białek przyłączonych do błony przez białka transbłonowe. W przypadku roślin, drożdży i bakterii kształt komórki i jej właściwości mechaniczne wynikają z obecności sztywnej ściany komórkowej – otaczającej błonę komórkową włóknistej warstwy białek, cukrów i innych makrocząsteczek. Natomiast błona komórkowa komórek zwierząt jest stabilizowana przez sieć włóknistych białek, nazwaną korą komórki, przymocowaną do cytozolowej powierzchni błony.

Kora ludzkiego erytrocytu ma stosunkowo prostą i regularną strukturę i została szczególnie dobrze zbadana. Erytrocyty są małe i mają charakterystyczny kształt obustronnie wklęsłych krążków (rys. 11.29A). Głównym składnikiem ich kory jest tworzące dimer białko spektryna, mające kształt wydłużonych, cienkich i giętkich pręcików o długości około 100 nm. Spektryna tworzy sieć, która stanowi podporę dla błony komórkowej i utrzymuje dwuwklęsły kształt komórki. Sieć spektrynowa jest połączona z błoną poprzez wewnątrzkomórkowe białka łączące, które wiążą spektrynę z określonymi białkami transbłonowymi (rys. 11.29B i film 11.7). Znaczenie tej sieci jest widoczne u myszy i ludzi, u których ze względu na zmiany genetyczne wytwarzana jest forma spektryny o nieprawidłowej strukturze. Osobniki takie cierpią na anemię, ponieważ liczba ich erytrocytów jest niższa od normy i ich erytrocyty zamiast być spłaszczone, są kuliste i wyjątkowo delikatne.

 

Rys. 11.29. Kora komórki zbudowana głównie ze spektryny nadaje charakterystyczny kształt ludzkim erytrocytom. (A) Skaningowa mikrografia elektronowa pokazująca ludzkie erytrocyty, które mają spłaszczony, dwuwklęsły kształt. Komórki te nie zawierają jądra i innych organelli wewnątrzkomórkowych. (B) W korze komórki erytrocytów dimery spektryny (kolor czerwony) są połączone końcami w dłuższe tetramery. Tetramery spektryny wraz z mniejszą liczbą cząsteczek aktyny tworzą sieć. Sieć ta połączona jest z błoną komórkową w wyniku wiązania co najmniej dwóch typów białek łącznikowych (zaznaczonych kolorem żółtym i niebieskim) z dwoma rodzajami białek transbłonowych (zaznaczonych kolorem zielonym i brązowym) (A: dzięki uprzejmości Bernadette Chailley)

Białka podobne do spektryny i związanych z nią białek łączących z błoną są obecne w korze większości komórek zwierząt. Ale kora w tych komórkach jest znacznie bardziej złożona niż ta w erytrocytach i jest szczególnie bogata w aktynę i białko motoryczne miozynę. O ile erytrocyty potrzebują swojej kory głównie w celu zapewnienia wytrzymałości mechanicznej w czasie przeciskania się przez wąskie naczynia krwionośne, o tyle inne komórki wykorzystują ją również do selektywnego pobierania materiałów ze swojego środowiska, zmiany kształtu i przemieszczania się, o czym będzie mowa w rozdziale 17. Ponadto komórki wykorzystują swoją korę, aby powstrzymać dyfuzję białek w błonie plazmatycznej, co teraz omówimy.

Komórka może ograniczać przemieszczanie się białek błonowych

Ponieważ błona jest definiowana jako dwuwymiarowy płyn, wiele jej białek, podobnie jak lipidów, może się swobodnie poruszać w płaszczyźnie dwuwarstwy. Tę dyfuzję boczną po raz pierwszy wykazano przez eksperymentalne połączenie komórki mysiej z komórką ludzką, co doprowadziło do utworzenia komórki hybrydowej o podwójnej wielkości, i sprawdzenie rozmieszczenia pewnych białek błony komórkowej tych komórek. Początkowo występowanie mysich i ludzkich białek jest ograniczone do odpowiednich połówek nowo utworzonej komórki hybrydowej, ale w ciągu około pół godziny białka te zostają równomiernie wymieszane na całej powierzchni komórki hybrydowej (rys. 11.30). Kilka innych technik badania ruchu białek błonowych opisujemy w panelu Skąd to wiemy.


Rys. 11.30. Powstanie komórek hybrydowych z komórek myszy i człowieka pokazuje, że niektóre białka błony komórkowej mogą się przemieszczać bocznie w dwuwarstwie lipidowej. Początkowo po połączeniu komórek mysich i ludzkich ich białka pozostają w odpowiednich połówkach nowo utworzonej hybrydowej błony komórkowej. Jednak w krótkim czasie białka błonowe – i lipidy – całkowicie się mieszają. Aby monitorować ruch wybranych białek, komórki są znakowane przeciwciałami, które wiążą się z białkami ludzkimi albo mysimi. Przeciwciała te są sprzężone z dwoma różnymi znacznikami fluorescencyjnymi – na przykład rodaminą (kolor czerwony) i fluoresceiną (zaznaczoną tutaj kolorem niebieskim), co umożliwia ich rozróżnienie w mikroskopie fluorescencyjnym (patrz panel 4.2) (na podstawie obserwacji: L.D. Frye i M. Edidin, J. Cell Sci. 7: 319–335, 1970)

Jednakże przedstawianie błony komórkowej jako morza lipidów, w którym swobodnie pływają wszystkie białka, jest zbytnim uproszczeniem. Komórki mają sposoby ograniczania obecności poszczególnych białek do określonych obszarów dwuwarstwy, tworząc w ten sposób funkcjonalnie wyspecjalizowane regiony lub domeny błonowe na powierzchni komórki lub organelli.

Jak pokazano na rysunku 11.31, białka błony komórkowej mogą zostać unieruchomione poprzez „zacumowanie” do struktur na zewnątrz komórki – na przykład do cząsteczek w macierzy zewnątrzkomórkowej lub na sąsiedniej komórce (co omówiono w rozdz. 20) – lub do stosunkowo nieruchomych struktur wewnątrz komórki, szczególnie do kory komórki (patrz rys. 11.29B). Dodatkowo komórki mogą tworzyć bariery, które ograniczają poszczególne składniki błony do jednej domeny tejże błony. Na przykład w komórkach nabłonkowych wyściełających jelito ważne jest, aby białka transportujące zaangażowane w pobieranie składników odżywczych z jelita były ograniczone do powierzchni szczytowej części komórek (zwróconej w stronę światła jelita), a obecność innych białek transportujących – w tym białek biorących udział w eksporcie substancji rozpuszczonych z komórki nabłonkowej do tkanek i krwiobiegu – ograniczona do powierzchni części podstawnej i bocznej (patrz rys. 12.17). Ten asymetryczny rozkład białek błonowych jest utrzymywany przez barierę wzdłuż miejsca zespolenia danej komórki z przyległymi komórkami nabłonkowymi, czyli tak zwane połączenie zamykające (rys. 11.32). W tym miejscu wyspecjalizowane białka łączące formują ciągły pas na obszarze kontaktu komórki z jej sąsiadami, tworząc ścisłe zespolenie między sąsiadującymi błonami komórkowymi (patrz rys. 20.22). Białka błonowe nie są w stanie dyfundować przez połączenie zamykające.


Rys. 11.31. Dyfuzja boczna białek w błonie komórkowej może być ograniczana na kilka sposobów. Białka mogą być mocowane (A) do kory komórki wewnątrz komórki, (B) do cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej poza komórką lub (C) do białek na powierzchni innej komórki. (D) Bariery dyfuzyjne (pokazane jako czarne słupki) mogą ograniczać występowanie białka do określonej domeny błonowej


Rys. 11.32. W błonie komórkowej komórki nabłonka jelita obecność białka jest ograniczona do określonej domeny tejże błony. Białko A (zielone) i białko B (czerwone) mogą dyfundować bocznie w obrębie domen błonowych, w których się znajdują, ale ich przejście do innej domeny uniemożliwiają wyspecjalizowane połączenia komórkowe nazywane połączeniami zamykającymi. błona podstawna (kolor żółty) to cienka warstwa macierzy zewnątrzkomórkowej, która stanowi podporę wszystkich komórek nabłonkowych (co omówiono w rozdz. 20)

Powierzchnia komórki pokryta jest węglowodanami

Dowiedzieliśmy się wcześniej, że niektóre lipidy w zewnętrznej warstwie błony komórkowej łączą się kowalencyjnie z cukrami. To samo dotyczy większości białek w błonie komórkowej. Do większości tych białek, nazywanych glikoproteinami, są przyłączone krótkie łańcuchy cukrowe, czyli oligosacharydy. Inne białka błonowe, proteoglikany, zawierają jeden lub więcej długich łańcuchów polisacharydowych. Wszystkie węglowodany wchodzące w skład glikoprotein, proteoglikanów i glikolipidów znajdują się tylko na jednej zewnętrznej (niecytozolowej) stronie błony komórkowej, gdzie tworzą płaszcz cukrowy nazywany warstwą węglowodanową lub glikokaliksem (rys. 11.33).


Rys. 11.33. Komórki eukariotyczne są opłaszczone cukrami. Ta bogata w węglowodany warstwa składa się z oligosacharydowych łańcuchów bocznych przyłączonych do glikolipidów błonowych i glikoprotein oraz łańcuchów polisacharydowych wchodzących w skład proteoglikanów błonowych. Jak pokazano, w tworzeniu glikokaliksu mogą również uczestniczyć glikoproteiny, które zostały wydzielone przez komórkę, a następnie zwrotnie przyłączone do jej powierzchni. Należy zauważyć, że cały węglowodan znajduje się na zewnętrznej (niecytozolowej) powierzchni błony plazmatycznej

Ta warstwa węglowodanów pomaga chronić powierzchnię komórki przed uszkodzeniami mechanicznymi. A ponieważ oligosacharydy i polisacharydy przyciągają cząsteczki wody, powierzchnia komórki staje się śliska. Pomaga to ruchliwym komórkom, takim jak leukocyty (krwinki białe), przeciskać się przez wąskie przestrzenie i zapobiega przywieraniu komórek krwi do siebie lub do ścian naczyń krwionośnych.

Jednak węglowodany na powierzchni komórki nie tylko chronią ją i zapewniają śliskość jej powierzchni. Odgrywają one również ważną rolę we wzajemnym rozpoznawaniu się komórek i ich przyleganiu (adhezji). Białka transbłonowe zwane lektynami są wyspecjalizowane w wiązaniu z łańcuchami bocznymi określonych oligosacharydów. Chociaż oligosacharydowe łańcuchy boczne glikoprotein i glikolipidów są krótkie (zawierają zazwyczaj mniej niż 15 jednostek cukrowych), to jednak wykazują ogromną różnorodność. W odróżnieniu od białek, w których wszystkie aminokwasy są połączone w łańcuch liniowo za pomocą identycznych wiązań peptydowych, cukry mogą być łączone w różny sposób, tworząc skomplikowane, rozgałęzione struktury oligosacharydowe (patrz panel 2.4). Już trzy różne cukry mogą być łączone ze sobą w tak różnych kombinacjach wiązań kowalencyjnych, że utworzą setki różnych trisacharydów.

SKĄD TO WIEMY?

POMIAR PŁYNNOŚCI BŁON

Istotną cechą dwuwarstwy lipidowej jest jej płynność, która jest kluczowa dla integralności i funkcji błon komórki. Ta właściwość pozwala wielu białkom osadzonym w błonie poruszać się w płaszczyźnie dwuwarstwy, dzięki czemu mogą one angażować się w różne oddziaływania białko–białko, od których to oddziaływań komórka jest zależna. Płynna natura błon w komórce jest tak ważna dla ich właściwej funkcji, że może wydawać się zaskakujące, iż ta właściwość została rozpoznana dopiero na początku lat 70. ubiegłego wieku.

Biorąc pod uwagę znaczenie tej cechy dla struktury i funkcji błony, zadajmy pytanie, jak mierzymy i badamy płynność błon komórki? Najbardziej powszechne są metody wizualne: po prostu znakuje się niektóre cząsteczki dwuwarstwy, a następnie obserwuje, jak się przemieszczają. Takie podejście po raz pierwszy wykazało ruch boczny białek błonowych, do których dołączono znakowane przeciwciała (patrz rys. 11.30). Ten eksperyment wydawał się sugerować, że białka błonowe dyfundują swobodnie, bez ograniczeń, w otwartym morzu lipidów. Teraz wiemy, że taka interpretacja nie jest poprawna. Aby dokładniej zbadać dynamikę błony, naukowcy musieli wynaleźć bardziej precyzyjne metody śledzenia ruchu białek w błonach, takich jak na przykład błona komórkowa żywej komórki.

Laserowy atak FRAP

Jedna z takich technik, nazwana odradzaniem się fluorescencji wygaszonej pulsem światła, FRAP (ang. fluorescence recovery after photobleaching), obejmuje jednolite znakowanie składników błony komórkowej – jej lipidów lub, częściej, białek – znacznikiem fluorescencyjnym. Znakowanie białek błonowych można osiągnąć przez inkubację komórek z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie lub przez kowalencyjne przyłączenie do białka błonowego białka zdolnego do fluorescencji, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP), przy wykorzystaniu techniki rekombinacji DNA omówionej w rozdziale 10.

Po wyznakowaniu białka mały fragment błony jest naświetlany intensywnym impulsem światła z ostro skupionej wiązki laserowej. Powoduje to nieodwracalne wygaszenie fluorescencji znakowanych białek w tym małym, o powierzchni około 1 μm2, fragmencie błony. Fluorescencja tej naświetlonej błony jest monitorowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego: mierzy się czas potrzebny sąsiednim, nietraktowanym światłem lasera, białkom zdolnym do fluorescencji na przemieszczenie się do wygaszonego obszaru błony (rys. 11.34). Szybkość tego „odradzania się fluorescencji” jest bezpośrednią miarą szybkości, z jaką cząsteczki białka mogą dyfundować w błonie (film 11.8). Takie eksperymenty wykazały, że ogólnie mówiąc, błony komórkowe są tak samo lepkie jak oliwa z oliwek.


Rys. 11.34. Techniki oparte na wygaszeniu fluorescencji światłem lasera, takie jak FRAP, można stosować do pomiaru szybkości dyfuzji bocznej białka błonowego. Dane białko błonowe można wyznakować przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie (jak pokazano tutaj) lub można przeprowadzić jego ekspresję po uprzedniej rekombinacji z genem kodującym białko zdolne do fluorescencji, takie jak GFP, uzyskując białko fuzyjne zdolne do fluorescencji. W technice FRAP cząsteczki zdolne do fluorescencji są wygaszane na małym obszarze błony za pomocą wiązki laserowej. Po pewnym czasie następuje powrót fluorescencji w to miejsce na skutek przemieszczania się na drodze dyfuzji „wygaszonych” i „niewygaszonych” cząsteczek białek (pokazane tutaj z boku i z góry). Współczynnik dyfuzji jest następnie obliczany z wykresu szybkości odzyskiwania fluorescencji: im większy współczynnik dyfuzji białka błonowego, tym odzyskiwanie fluorescencji jest szybsze